[发明专利]一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法

权利要求书

1.一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于包括以下几个步骤:

步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；

步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；

步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至-196℃；

步骤四：存入液氮罐中保存。

2.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述次声波的频率为8~13Hz。

3.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述渗透性保护液为DMSO和聚乙二醇的混合溶液。

4.如权利要求1或3所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述渗透性保护液为40%的DMSO和60%的聚乙二醇。

5.如权利要求1所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述单糖为葡萄糖和果糖的混合溶液。

6.如权利要求5所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述单糖包括0.3%~0.5%的葡萄糖和0.5%~0.7%的果糖。

7.如权利要求5所述的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于：所述Rho抑制剂为Y-27632、法苏地尔和羟基法苏地尔中的一种或几种。