[发明专利]一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法

摘要

本发明公开了一种冷沉淀与组分I沉淀混合投料同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，步骤包括：（1）冷沉淀与组分I同时投料、溶解；（2）DEAE Sephadex A-50 凝胶吸附；（3）S/D病毒灭活；（4）阴离子交换柱层析；（5）层析穿透液经两步低温乙醇沉淀纯化、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得人纤维蛋白原；（6）层析洗脱液进一步疏水柱层析；（7）疏水柱洗脱液经超滤、纳米膜过滤、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得高纯人凝血因子VIII。本发明工艺将两种原料均含有的FVIII与Fg同时提取出来，大大提高了两种产品的得率，其中人凝血因子VIII可达20万IU/吨血浆，人纤维蛋白原超过2000瓶/吨血浆，均远高于传统工艺。

主权项

一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法，其特征在于：生产流程包括如下步骤:（1）冷沉淀与组分I沉淀制取将新鲜冰冻血浆融化，保持血浆温度在1‑3℃，离心得到冷沉淀，保持0‑5℃，暂存；在去冷沉淀血浆中加入‑20℃以下的低温95%乙醇，使血浆中乙醇含量约7‑9%,调节PH值至6.80‑7.00，在‑1~‑3℃下离心得到组分I沉淀；然后立即将冷沉淀与组分I沉淀合并在一起，切成碎块；（2）冷沉淀与组分I沉淀共溶解并压滤按1：10~20的重量比，将切成碎块的新鲜冷沉淀及组分I沉淀一起投入预先配制的溶解缓冲液1中，温度控制在15‑30℃，搅拌2.5‑5小时，使其充分溶解；然后用PALL公司生产的Supradur 50P滤板串联0.45µm滤芯压滤，收集澄清滤液；过滤前用溶解缓冲液1预洗滤板及滤芯；（3）DEAE Sephadex A‑50 凝胶吸附并过滤在步骤（2）收集的滤液中加入预先用65℃以上的热注射用水溶胀后用25℃以下的冷注射用水冷却再用步骤（2）所述溶解缓冲液1平衡的DEAE Sephadex A‑50凝胶,按凝胶溶胀前的重量（干重）计，凝胶的加入量为0.5‑1.5克/kg溶解缓冲液1；凝胶加入到滤液后缓慢搅拌45‑75分钟，后静置5‑10分钟；然后过滤，收集滤液；（4）S/D病毒灭活在步骤（3）收集的滤液中加入Tween80 至1.0%（wt%）,TNBP（磷酸三丁酯） 至0.3%（wt%），搅匀后升温至24‑26℃，后保温6‑8小时，然后用0.45µm滤芯过滤，收集滤液；（5） 阴离子交换柱层析步骤（4）收集的滤液上阴离子交换柱进行层析，柱子预先用平衡缓冲液1充分平衡；上柱过程中，收集穿透液，上柱结束后，用平衡缓冲液1冲洗柱子，将冲洗液并入穿透液中；后用洗涤缓冲液1洗涤柱子，再用洗脱缓冲液1洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液,及时用0.45µm滤芯进行过滤,收集滤液；洗脱液的滤液按照以下6A‑11A步骤进行，而流穿液按6B‑11B步骤进行；（6A）疏水柱层析；以上洗脱液滤液中加入氯化钠至1.8M‑2.5M,然后上疏水柱, 柱子预先用平衡缓冲液2充分平衡；上柱结束后用平衡缓冲液2冲洗柱子，后用洗涤缓冲液2洗涤柱子，再用洗脱缓冲液2洗脱，收集洗脱液即为高纯FVIII溶液；用0.45µm或0.22µm滤芯过滤，收集滤液；（7A）用10K~30K的超滤膜浓缩以上滤液，然后恒体积透析4‑6倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；（8A）调节FVIII含量至所需值（一般规格为20‑30IU/ml），加入稳定剂，后调PH值至6.50‑7.50；（9A）用0.1µm滤芯串联15‑20纳米滤芯进行除病毒过滤（10A）用0.22µm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；（11A）冻干；（12A）干热病毒灭活将人凝血因子VIII冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活；（6B） 将流穿液温度降至‑2~0℃时，缓慢加入‑20℃以下的低温95%乙醇溶液至浓度为7‑9%（V/V）,调解PH值至6.80‑7.20，保持温度‑3.0‑0℃，均匀搅拌1.5‑3小时后离心，得到第一次Fg沉淀，立即切碎；（7B）按1：10‑20的稀释比，将以上切碎的新鲜Fg沉淀投入预先配制的溶解缓冲液2中溶解，在20‑30℃下均匀搅拌2‑3小时；用30SP深层滤芯(3M公司CUNO滤芯)串联一只1.0µm的滤芯过滤悬浮液；用上述溶解缓冲液2后洗滤芯，收集滤液；（8B）将滤液降温至‑1℃左右，缓慢加入低温乙醇（不高于‑20℃）至7‑9%；搅拌2‑3小时，低温（‑2‑0℃）离心，得到第二次Fg沉淀，立即切碎；（9B）根据终产品的蛋白浓度要求（一般为2.5‑6.0%），将以上切碎的新鲜沉淀投入预先配制的溶解缓冲液3中，在20‑30℃下搅拌0.5‑2小时，后调节蛋白浓度至所需值，调PH值至6.50‑7.50，用0.45µm的滤芯过滤并用溶解缓冲液3后洗滤芯，收集滤液；（10B）除菌过滤并分装；（11B）冻干；（12B）干热病毒灭活将人纤维蛋白原冻干制剂在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。