[发明专利]一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法

说明书

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及一种血液制品的制备，具体讲是涉及一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法。

背景技术

人凝血因子VIII(FVIII)是在肝脏中合成的人体凝血因子之一，有2332个氨基酸残基，由两条肽链所组成，重链分子量为90～200kDa；轻链分子量为80kDa，二条肽链间由Ca²⁺连接。在人体内的半衰期8~12小时，血浆中的含量仅为0.05～0.1mg/升。FVIII缺乏会导致甲型血友病发生，该病是一种遗传性疾病，患者多为男性，发病率约1/10000~1/5000，患者出血部位集中于关节、肌肉和内脏。其中，关节反复出血导致骨骼变形，肌肉萎缩；而内脏和颅内出血则会危及生命。甲型血友病因属遗传性疾病,目前尚无根治的方法，只能通过输注FⅧ制剂进行替代性治疗，只要定期输注FⅧ制剂，甲型血友病患者完全可以像正常人一样生活。

人纤维蛋白原（humanfibrinogen，简称Fg）,是一种含2964个氨基酸、具有凝血功能的蛋白质,由肝脏合成，它是人体所有凝血因子中含量最大的一种，血浆中含量2～4克/升，分子量340KD，半衰期4～6日，等电点5.10-5.50，沉降系数7.70-7.90。Fg由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。人体凝血的最后阶段是在凝血酶作用下，Fg的α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体，进一步在Ca²⁺与活化的XIII因子作用下，单体之间以共价键相连，变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块，从而完成凝血过程。Fg缺乏会导致各类凝血方面的疾病，常见的包括：先天性纤维蛋白原减少或缺乏症,以及因肝损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、外伤、产后大出血、大手术、内出血等导致的后天性纤维蛋白原缺少症。因先天因素引起的Fg减少或缺乏症,补充Fg是目前唯一可靠的治疗方法,而对于后天因素引起的Fg减少或缺乏,根据病因的不同,也需输注不同剂量的Fg。Fg除直接参与凝血过程外,还可介导血小板聚集,影响血液粘度,是心、脑血管病发病的重要危险因素，在动脉粥样硬化的形成及肿瘤血行转移等病理过程中也起重要作用。

近年来，一种具有高效止血功能的外科用血液制品——人纤维蛋白粘合剂在临床上的应用越来越广泛，也使得作为该药配伍之一的高浓度人纤维蛋白原的需求量大增.人纤维蛋白粘合剂所用的Fg与常规静脉输注的Fg很大的不同，主要体现在前者具有很高的蛋白浓度，至少是后者（一般为2.5%）的二倍或者更高。

Fg制品最大的问题在于冻干粉复溶时间长且溶解时需在30-37℃的水浴中进行，另一个问题是容易产生蛋白析出及蛋白颗粒悬浮，这给临床使用带来了不便，譬如必须提前从冰箱里取出置于水浴中，静脉输注时需配备过滤装置。低浓度人纤维蛋白原尚且如此，高浓度人纤维蛋白原的复溶就更困难了。因此用常规的人纤维蛋白原生产工艺很难制备出合格的高浓度纤维蛋白原产品。

目前，国内血制品公司供应市场的FⅧ产品数量十分有限，患者经常面临无药可用的情况，严重危害患者的健康和生命安全。国内目前血制品厂家的FVIII制备工艺得率普遍较低，一般不高于10万IU/吨血浆（FVIII含量一般为70~80万IU/吨血浆），同时产品纯度不高，比活一般不高于50IU/mg，另外产品的外观欠佳，冻干粉不成饼状，复溶后乳光较重，有的还有蛋白析出。

目前我国也仅有少数几家血制品公司具有人纤维蛋白原的生产能力，但产量均不大，有的公司生产断断续续，基本处于停顿状态，因而纤维蛋白原在临床上也处于供应不足的状态,作为人纤维蛋白粘合剂配伍的高浓度人纤维蛋白原,由于技术难度较高,国内仅个别厂家有能力生产。

传统的生产工艺，大都是用冷沉淀生产人凝血因子VIII,用组分I生产人纤维蛋白原，这种工艺的缺点在于，冷沉淀中含有的人纤维蛋白原（约占血浆Fg的20%）被当作生产废料扔掉了；同样地，组分I中含有的大量FVIII也未回收利用而白白损失。

鉴于此,本发明开发了一种冷沉淀与组分I沉淀混合投料，同时制备高纯FVIII与人纤维蛋白原的新工艺，降低了劳动强度，缩短了生产周期，大大提高了FVIII与Fg的得率与纯度，明显改善了人纤维蛋白原的品质，使得高浓度纤维蛋白原的外观得到明显改善，复溶时间大大缩短，可以大规模进行生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产品质量好、得率高、生产成本低及生产效率高的同时制备人凝血因子VIII及纤维蛋白原的方法。