[发明专利]通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法

摘要

本发明涉及通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，属于医学动物疾病模型领域；本方法主要包括P53基因TALEN靶点的设计，P53基因敲除TALEN质粒pCAG‑pP53‑L和pCAG‑pP53‑R的组装，TALEN质粒的转染，筛选并获得P53基因敲除阳性细胞系，利用体细胞核移植技术构建重构胚，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育后获得敲除P53基因仔猪，通过检测克隆仔猪组织中P53基因及其下游相关基因的RNA及蛋白质表达水平来验证P53基因的功能，采用组织病理学及免疫组化法鉴定仔猪组织中的淋巴瘤；该淋巴瘤疾病模型的建立对开展人类淋巴瘤的发生、形成以及药物的研发具有重要的意义，为人类淋巴瘤疾病的研究和治疗提供了可靠的模型。

主权项

1.通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，其特征在于：所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法具体步骤为：第一步、P53基因敲除TALEN质粒对的设计、组装及胞外活性检测1) 根据NCBI上猪P53基因序列在第四外显子区域设计TALEN靶点；2) 组装TALEN 质粒pCAG‑pP53‑L 和pCAG‑pP53‑R，针对左边TALEN 识别序列:TCTGGAACAGCCAAGT，RVD序列如下：NG HD NG NN NN NI NI HD NI NN HD HD NI NI NN NG ；针对右边TALEN识别序列：CCCTCAAGGCCACTGAC，RVD 序列如下：HD HD HD NG HD NI NI NN NN HD HD NI HD NG NN NI HD，根据左右RVD序列分别对应组装成质粒pCAG‑pP53‑L和pCAG‑pP53‑R；3)TALEN 质粒对的胞外活性检测，一个终止子在luciferase 的编码区中央，luciferase 没有活性，为检测TALEN 剪切活性，将一个TALEN 的靶点位置序列插在终止子后，在TALEN 的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase ；通过与参照的比值变化反应TALEN 剪切的活性水平；4)将获得的有活性的质粒pCAG‑pP53‑L和pCAG‑pP53‑R去内毒素质粒大提，‑20℃保存备用；第二步、细胞转染、筛选及P53阳性细胞系的获得1) 转染前3天复苏滇南小耳猪原代胎儿成纤维细胞，利用胰酶消化贴壁细胞，离心收集细胞，收集细胞数为7×105个，利用电击缓冲液进行悬浮，同时加入pCAG‑pP53‑L和pCAG‑pP53‑R质粒，调节使最终体积为700ul，再将混合液放入到0.4cm 的电击杯中，选择方波，在电压250V，25ms条件下进行1次脉冲电击，将电击后的细胞悬浮液转移到100mm 培养皿中，加入DMEM，继续培养；2) 转染48小时后，利用胰酶消化转染后贴壁的细胞，采用极度稀释培养法培养，最终稀释为100ul悬液中细胞的数目为95‑105个，稀释培养10‑13天细胞即长成所需的单细胞克隆；3) 提取各细胞克隆DNA为模板，使用特异性引物进行扩增，将PCR 产物通过T7E1酶切和测序的方法，以确定各细胞克隆P53基因敲除情况，鉴定为双敲的细胞克隆继续培养及冻存，留作体细胞核移植备用；第三步、体细胞核移植及胚胎移植1) 卵母细胞的成熟培养a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；b、挑选直径为3‑6mm 的卵泡从中抽取卵丘‑卵母细胞复合体，放入添加0.1mg.ml‑1丙酮酸、0.1mg.ml‑1L‑半胱氨酸盐酸、10％猪卵泡液、10ng.mL‑1EGF 的TCM‑199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38‑42h；2) 构建敲除P53基因的重构胚a、取敲除P53基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM培养48h，使体细胞处于G0或G1期；b、卵丘‑卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5‑1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将敲除P53基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中；3) 电融合和电激活重构胚再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm 脉冲电压，脉冲时程为 20μs 的电融合参数下进行1次脉冲重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23 培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm 脉冲电压，脉冲时程为100μs 的参数下进行1次电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL‑1CB 的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；4) 体外培养将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3 培养液中，置于三气培养箱中培养48h和7d后分别观察记录重构胚胎的卵裂率，并用Hoechst33342 对囊胚染色，测定囊胚的细胞数；5) 选取自然发情的代孕母猪进行胚胎移植，将重构胚移植到其体内继续发育，待代孕母猪妊娠114天后分娩获得敲除P53基因的克隆仔猪；第四步、克隆猪P53基因敲除的验证仔猪出生后用手术剪刀剪取0.5×0.5cm的耳组织，按照Tissue DNA Kit 的OMEGA，D3396‑02步骤提取各仔猪DNA，使用特异性引物扩增靶点序列，通过T7E1 酶切、测序以判断各仔猪P53 基因是否敲除；第五步、敲除P53基因克隆仔猪组织、器官中淋巴瘤的鉴定采用组织免疫学以及免疫组化染色的方法，鉴定小型猪中各组织器官中淋巴瘤的发生以及形成情况。