[发明专利]通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法

说明书

本发明涉及通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，属于医学动物疾病模型领域；本方法主要包括P53基因TALEN靶点的设计，P53基因敲除TALEN质粒pCAG‑pP53‑L和pCAG‑pP53‑R的组装，TALEN质粒的转染，筛选并获得P53基因敲除阳性细胞系，利用体细胞核移植技术构建重构胚，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育后获得敲除P53基因仔猪，通过检测克隆仔猪组织中P53基因及其下游相关基因的RNA及蛋白质表达水平来验证P53基因的功能，采用组织病理学及免疫组化法鉴定仔猪组织中的淋巴瘤；该淋巴瘤疾病模型的建立对开展人类淋巴瘤的发生、形成以及药物的研发具有重要的意义，为人类淋巴瘤疾病的研究和治疗提供了可靠的模型。

技术领域

本发明涉及通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，属于医学动物疾病模型领域。

背景技术

淋巴瘤起源于淋巴结和淋巴组织，其发生与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的免疫细胞恶变相关，是血液系统中的恶性肿瘤，据报道，人类淋巴瘤的发病率有逐年上升的趋势，男性为1.39/10万,女性为0.84/10万，欧美国家及日本的发病率明显高于国内，而且在城市的发病率远高于农村，以20岁至40岁的青壮年多见，一旦发病，治愈非常困难，这在很大程度上危害了人类的生命健康。

P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因之一，是当前肿瘤分子生物学研究的焦点，据相关资料报道，P53基因是人体的抑癌基因，科学家对基因的结构和功能做了大量深入细致的研究发现，超过50％的人类肿瘤与P53基因的异常有关，P53基因失活可诱导细胞生长停止、细胞凋亡、细胞分化以及DNA修复异常，从而导致肿瘤的形成，然而，目前人类肿瘤的治疗方法主要依靠手术、放疗、化疗、免疫治疗及中西医结合治疗等治疗手段，但是面临着治愈率极低、治疗成本昂贵等的问题，因此，人们越来越关注从“治本”上来提高肿瘤治愈率，通过基因药物的研究治疗就成为了人类21世纪治愈肿瘤的必由之路。

猪的主要生理结构、生化指标、代谢特点都与人极为相似，小型猪体形小，更利于实验过程中的操作和管理，相对于猴等动物建立的疾病模型而言，繁殖更快、成本也较低，在生命科学的研究中具有独特的优越性和应用价值，而通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法目前还未见报道。

猪等动物疾病模型的建立为人类淋巴瘤疾病的研究和治疗奠定了重要的物质基础，对于开发人类淋巴瘤等相关疾病治疗的基因药物具有重要的指导意义。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，该方法操作简单、科学合理、可靠性高、且易于实现，为淋巴瘤以及相关疾病的发病机理、基因治疗方法的研究提供了重要的参考。

为了实现本发明目的，本发明采用的方法：

所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法具体步骤为：

第一步、P53基因敲除TALEN质粒对的设计、组装及胞外活性检测

1)根据NCBI上猪P53基因序列在第四外显子区域设计TALEN靶点；

2)组装TALEN质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R，针对左边TALEN识别序列:TCTGGAACAGCCAAGT，RVD序列如下：NG HD NG NN NN NI NI HD NI NN HD HD NI NI NN NG；针对右边TALEN识别序列：CCCTCAAGGCCACTGAC，RVD序列如下：HD HD HD NG HD NI NI NNNN HD HD NI HD NG NN NI HD，根据左右RVD序列分别对应组装成质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R；