[发明专利]检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的特异引物及检测方法

摘要

本发明针对烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变开发了特异引物及检测方法。其特征在于，特异引物包括两条上游引物CPS2‑1F和CPS2‑2F以及一条公用下游引物CPS2‑R。检测方法为：基于等位基因特异PCR(AS‑PCR)原理，在冷杉醇合成关键基因NtCPS2的SNP突变位点处设计两条互补的上游引物，在其下游设计一条共用下游引物。以待测烟草品种的DNA为模板，使用两对特异性引物进行PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有297bp的特征条带。本发明设计的引物对具有操作简便、费用低廉、结果可靠、检测速度快，可区分杂合或纯合等优点，能够大大加快冷杉醇特异香气性状选育进程，缩短育种周期，提高育种效率。

主权项

1.一种检测烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2单核苷酸突变的检测方法，包括以下步骤：S1，根据烟草冷杉醇合成关键基因NtCPS2的第四号外显子cDNA序列，基于AS‑PCR原理，在SNP突变处设计两个上游引物，使引物的3′末端核苷酸与SNP位点一致，同时在引物3′末端倒数第三位人工引入错配碱基T，在第四号外显子末端设计一个公用的下游引物，这样构成的两对引物形成互补引物，能够相互检测SNP的类型，同时也能够检测后代为杂合体或纯合体；两个上游引物CPS2‑1F和CPS2‑2F以及公用下游引物CPS2‑R：上游引物CPS2‑1F 5′‑3′：ACAGATGAAAGGTTTGATAG上游引物CPS2‑2F 5′‑3′：ACAGATGAAAGGTTTGATAT下游引物CPS2‑R 5′‑3′：TCTCTTATGAAGGCACGTGT；NtCPS2的第四号外显子序列：S2，提取被检测烟草品种的DNA；S3，以被检测烟草品种的DNA为模板，使用NtCPS2基因特异性引物对被检测烟草品种的DNA进行PCR扩增；S4，采用电泳检测PCR扩增产物，判断PCR扩增产物是否含有292bp的特征条带：如果引物对CPS2‑1F/CPS2‑R有条带，而引物对CPS2‑2F/CPS2‑R无条带，则被检测烟草品种为正常纯合型G，有冷杉醇合成；反之，则被检测烟草品种为突变纯合型T，不合成冷杉醇；如果这两对引物都有扩增条带，则说明检测品种为杂合型。