[发明专利]指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒，其采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材四个基因的表达值，所用引物序列如下：SEQ1；SEQ2；SEQ3；SEQ4；其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因。本发明采用二代测序技术及HPLC技术鉴定到三个和苁蓉总苷含量协同变化的基因，利用实时荧光定量PCR快速指示生药材主要药用成分含量的方法，为肉苁蓉生药材分级、高效的产品开发等应用提供指导及标准参考；具有特异性强、灵敏度高、高效快速的特点。

主权项

1.一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法，其特征在于：采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材中下述引物序列所对应基因的表达：SEQ1：正向引物GCAGCGCCATTATTTGAAC，反向引物AGAGGGGACATGAATCACC；SEQ2：正向引物GCAGACATGGATGCCCTAC，反向引物TAATTTGGCTGCTCCAAGC；SEQ3：正向引物GACGGCCAAGCTCTTAGTG，反向引物CTTCCAACATAGCCCACG；SEQ4：正向引物CCCTTTACGCTCGTTTGG，反向引物TGAATCAAAGACGGTGGAAC；其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因；其包括下述步骤：(1)RNA提取及cDNA反转：提取待测肉苁蓉的总RNA，RNA经纯化后进行逆转录反应；(2)PCR扩增：对提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3进行RT‑qPCR反应，SEQ4作为内参基因；(3)计算总苷含量：A、将生药材分别分为3个等级，内蒙古阿拉善盟右旗为G1 0～2.5％、G2 2.5％～6.8％和G3 6.8％～14.6％，内蒙古阿拉善盟左旗为G1 0～1.2％、G2 1.2％～2.5％和G3 2.5％～6.0％；B、根据PCR扩增得到的CT值，采用式(Ⅰ)计算SEQ1、SEQ2和SEQ3三个基因的ΔCT；记为分别与SEQ1、SEQ2、SEQ3对应的n1、n2、n3；nx＝2‑ΔCT＝2‑(CT(所测基因)‑CT(内参基因))     (Ⅰ)其中，x＝1、2、3，分别对应SEQ1、SEQ2、SEQ3；C、将n1、n2、n3分别与Ni1、Ni2、Ni3按照公式(Ⅱ)计算Pi；其中，i＝1、2、3，分别对应G1、G2、G3；内蒙古阿拉善盟右旗中：N11＝0.04、N12＝3.33、N13＝0.38，N21＝0.01、N22＝8.02、N23＝0.06，N31＝0、N32＝21.33、N33＝0.02；内蒙古阿拉善盟左旗中：N11＝0.02、N12＝1.63、N13＝0.01，N21＝0.01、N22＝4.50、N23＝0.04，N31＝0、N32＝9.64、N33＝0.01；D、比较P1、P2、P3，总苷含量处于最小Pi所对应的Gi的范围内。