[发明专利]指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒，其采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材四个基因的表达值，所用引物序列如下：SEQ1；SEQ2；SEQ3；SEQ4；其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因。本发明采用二代测序技术及HPLC技术鉴定到三个和苁蓉总苷含量协同变化的基因，利用实时荧光定量PCR快速指示生药材主要药用成分含量的方法，为肉苁蓉生药材分级、高效的产品开发等应用提供指导及标准参考；具有特异性强、灵敏度高、高效快速的特点。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，是一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

肉苁蓉被称为“沙漠人参”，具有极高的药用价值，是广泛使用的中国传统的名贵中药材，早在1,800多年前的《神农本草经》就已有记载。肉苁蓉味甘、性温，具有补肾壮阳、增强免疫、养血润燥、延年益寿、保肝护肝等功效。肉苁蓉药食两用，在历史上就被西域各国作为珍品上贡朝廷，也是历代补肾壮阳类处方中使用频度最高的补益药物之一。肉苁蓉的宜食人群主要包括：体虚便秘、产后便秘、病后便秘及老年便秘者；患有男子遗精、早泄、阳痿、精子稀少不育等病症者；妇女带下、不孕症、四肢不温、月经不调、腰膝酸痛等病症患者以及高血压患者。忌食人群主要是经常大便溏薄者。

目前，家庭生活中，肉苁蓉主要用于泡酒、泡茶、煮粥、炖汤等，国内外都有众多的肉苁蓉制品投放市场，有肉苁蓉优质饮片、提取物、配方颗粒、肉苁蓉胶囊、茶包、速溶茶、肉苁蓉酒保健品等。近年来随着人民生活水平的提高和人口老龄化，人们对保健品的需求量也越来越大，因此肉苁蓉的用量也逐年增大。但是在肉苁蓉的生药材市场中，其来源混乱，主要药用成分差异不明确，分级开发及应用还有待提高和加强。

肉苁蓉的主要药用成分为苯乙醇苷(Phenylethanoid glycosides,PhGs)类化合物，随着分离提取和检测技术的飞速发展，至今已从肉苁蓉肉质茎中分离出20多种类型的苯乙醇苷，目前，对肉苁蓉的质量评价主要是对其所含的松果菊苷和毛蕊花糖苷进行测定，《中国药典》2010年版肉苁蓉项下也将上述两个成分定为药用价值指标。常用的测定方法有薄层色谱(TLC)分析和高效液相色谱法(HPLC)等。但是，对于肉苁蓉苯乙醇苷含量的检测，上述这些主要的检测方法，都需要将采挖回来的肉苁蓉，先进行至少半个月的晾干处理，晾干后进行研磨，该过程耗时长，且实验流程繁琐、复杂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在生药材采挖后提供一种简单有效的快速指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的方法；本发明还提供一种指示肉苁蓉生药材总苷含量范围的快速检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：采用实时荧光定量PCR法测定肉苁蓉生药材中下述引物序列所扩增基因的表达值：

SEQ1：正向引物GCAGCGCCATTATTTGAAC，反向引物AGAGGGGACATGAATCACC；

SEQ2：正向引物GCAGACATGGATGCCCTAC，反向引物TAATTTGGCTGCTCCAAGC；

SEQ3：正向引物GACGGCCAAGCTCTTAGTG，反向引物CTTCCAACATAGCCCACG；

SEQ4：正向引物CCCTTTACGCTCGTTTGG，反向引物TGAATCAAAGACGGTGGAAC；

其中基因SEQ2为与总苷含量呈正相关，基因SEQ1和基因SEQ3呈负相关；基因SEQ4为内参基因。

本发明包括下述步骤：

(1)RNA提取及cDNA反转：提取待测肉苁蓉的总RNA，RNA经纯化后进行逆转录反应；

(2)PCR扩增：对提取RNA的SEQ1、SEQ2和SEQ3进行RT-qPCR反应，SEQ4作为内参基因；