[发明专利]一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法

摘要

本发明提供一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法，通过将动物跟腱采用特殊的酶解、自组装、凝胶层析、透析等纯化过程制得纯度大于99%的高纯度胶原蛋白，再通过特殊的冷冻干燥程序制备出的胶原蛋白海绵。本发明提供的一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法，制备的胶原蛋白海绵具有完整的二次自组装三螺旋结构，表面平整细腻，质地柔软，可用于自然腔道填充，可用于创面快速止血，可有效快速止血，防止创面血液渗出，低免疫原性，使胶原蛋白海绵的安全性得到更好的保障。

主权项

一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取动物跟腱，清洗、冰冻切片后除脂、清洗，备用；2)取步骤1)的跟腱片，分散于水中，再加入胰蛋白酶处理并清洗；3)取步骤2)的跟腱片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反应后收集酶解液；4)在步骤3)中获得的酶解液中加入硫酸钠水溶液，搅拌后静置，取沉淀产物离心后收集沉淀物A；5)取步骤4)中获得的沉淀物A，加水重溶并调节pH，静置，将再次沉淀产物重复进行离心清洗后收集沉淀物B；6)将步骤5)中获得的沉淀物B，加酸溶解后纯化，纯化完成后收集液体；7)将6)中收集到的纯化后胶原蛋白液体进行透析，透析后脱水浓缩，获得胶原原液，再将胶原原液进行冷冻干燥，即得胶原蛋白海绵；所述除脂是将跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗；所述除脂液为碳酸氢钠与乙醇水溶液的混合液；步骤2)中，所述跟腱片与水的质液比为1：10‑100；所述胰蛋白酶与水加入的质液比为25‑250：100000；所述胰蛋白酶处理条件为：反应温度：35‑40℃，反应时间：0.5‑2h；步骤4)中，所述硫酸钠水溶液与酶解液加入的体积之比为1：1‑4；所述搅拌条件为：搅拌时间为1‑10min，搅拌器转速：1～10rpm/min；所述静置时间为12‑24h；步骤6)中，所述酸为弱酸稀溶液，所述弱酸稀溶液为乙酸水溶液，其摩尔浓度为0.01‑0.3M；所述纯化采用Akata蛋白纯化系统，在Superdex‑200凝胶柱中纯化；步骤7)中，所述脱水浓缩的条件为：透析外液：分子量十万以上的聚乙二醇水溶液，透析外液浓度：0.1‑10％，脱水浓缩时间：12‑20h，浓缩后胶原蛋白液体的浓度：5‑20mg/mL；所述冷冻干燥采用冻干机冻干方式进行。