[发明专利]一种具有生物活性的高纯度胶原蛋白海绵及其制备方法

权利要求书

1.一种胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取动物跟腱，清洗、冰冻切片后除脂、清洗，备用；

2)取步骤1)的跟腱片，分散于水中，再加入胰蛋白酶处理并清洗；

3)取步骤2)的跟腱片加酸浸泡后分散，再在分散液中加入胃蛋白酶，反应后收集酶解液；

4)在步骤3)中获得的酶解液中加入硫酸钠水溶液，搅拌后静置，取沉淀产物离心后收集沉淀物A；

5)取步骤4)中获得的沉淀物A，加水重溶并调节pH，静置，将再次沉淀产物重复进行离心清洗后收集沉淀物B；

6)将步骤5)中获得的沉淀物B，加酸溶解后纯化，纯化完成后收集液体；

7)将6)中收集到的纯化后胶原蛋白液体进行透析，透析后脱水浓缩，获得胶原原液，再将胶原原液进行冷冻干燥，即得胶原蛋白海绵；

所述除脂是将跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗；所述除脂液为碳酸氢钠与乙醇水溶液的混合液；

步骤2)中，所述跟腱片与水的质液比为1：10-100；所述胰蛋白酶与水加入的质液比为25-250：100000；所述胰蛋白酶处理条件为：反应温度：35-40℃，反应时间：0.5-2h；

步骤4)中，所述硫酸钠水溶液与酶解液加入的体积之比为1：1-4；所述搅拌条件为：搅拌时间为1-10min，搅拌器转速：1～10rpm/min；所述静置时间为12-24h；

步骤6)中，所述酸为弱酸稀溶液，所述弱酸稀溶液为乙酸水溶液，其摩尔浓度为0.01-0.3M；

所述纯化采用Akata蛋白纯化系统，在Superdex-200凝胶柱中纯化；

步骤7)中，所述脱水浓缩的条件为：透析外液：分子量十万以上的聚乙二醇水溶液，透析外液浓度：0.1-10％，脱水浓缩时间：12-20h，浓缩后胶原蛋白液体的浓度：5-20mg/mL；

所述冷冻干燥采用冻干机冻干方式进行。

2.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述冰冻的条件为：冰冻温度：-20至-40℃，冰冻时间≥12h，所述动物跟腱避免反复冻融；所述除脂是将跟腱片用除脂液浸泡后再用水清洗；所述跟腱片与除脂液加入的质液比为1：10-25。

3.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述跟腱片与酸加入的质液比为1：50-150；所述酸选自乙酸、盐酸中的任意一种；所述酸浸泡时间为0.5-4h。

4.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述跟腱片与胃蛋白酶加入的质量之比为20-200：1；所述酶解的条件为：反应温度：0-20℃，反应时间：24-96h，搅拌周期：每隔1h搅拌5-15min，搅拌速率：50～100rpm/min。

5.根据权利要求1所述的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，步骤7)中，所述透析依次分别采用透析外液、纯化水进行透析；所述透析外液为磷酸氢二钠水溶液；所述透析条件为：透析温度：2-8℃，透析外液的透析次数：1次，透析外液的一次透析时间：12-24h，纯化水的透析次数：2-5次，纯化水的一次透析时间：3-9h。

6.一种胶原蛋白海绵，由权利要求1-5任一所述的胶原蛋白海绵的制备方法制得。