[发明专利]一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法

摘要

本发明公开了一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，适用于骨髓、脂肪、脐带来源的间充质干细胞培养。本发明采用无血清完全培养基进行脐带组织来源的间充质干细胞的培养，应用二次接种的方法对传统方法进行了改进，提高了原代细胞的获得率；同时本发明应用咪唑喹啉R848 1～5μg/mL和重组人干扰素IFN‑α‑2b 100～200U/mL作为预处理因子，明显地诱导了MSCs高表达和分泌细胞因子VEGF，HGF和PGE‑2，使其更好地发挥其免疫调节和促进组织再生的能力，可明显地提高MSCs的增殖能力和抵抗NK细胞杀伤的能力，同时预处理后的MSCs具有增强的抑制淋巴细胞增殖的能力，更好地应用于以T细胞为主的GVHD和其他自身免疫性疾病的治疗。

主权项

1.一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：一、脐带采集和间充质干细胞分离培养(1)、取正常足月产健康新生儿脐带10～15cm，立即放入加有10～20％质量分数的双抗溶液的DMEM培养基中；(2)、超净台内取出脐带，用75％酒精消毒脐带表面，用生理盐水充分洗涤残留的血液；将脐带剪成1～2cm小段，再次漂洗；剖开脐带，提出脐静脉和脐动脉，将剩余的华通氏胶脐带组织剪成1～2mm3大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0.5～1.0cm，将培养瓶置于37℃、5％体积浓度的CO2培养箱中孵育；(3)、第二天添加无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80‑90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；(4)、细胞传代应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化融合度为80～90％的P0代细胞5～10min，待细胞和残余组织块悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以100μm的滤器过滤细胞，收集滤液，以1500rpm离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×105/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P1代细胞；(5)、待P1代细胞到达80‑90％融合度时，应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化5～10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以1500rpm离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×105/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P2代细胞；按照此种方法，将MSCs连续传代；(6)选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定；二、MSCs的预处理选取P3代细胞，在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉R848 1～5μg/mL和重组人干扰素IFN‑α‑2b 100～200U/mL，继续培养24‑72小时；处理后进行继续传代。