[发明专利]一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法

权利要求书

1.一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

一、脐带采集和间充质干细胞分离培养

(1)、取正常足月产健康新生儿脐带10～15cm，立即放入加有10～20％质量分数的双抗溶液的DMEM培养基中；

(2)、超净台内取出脐带，用75％酒精消毒脐带表面，用生理盐水充分洗涤残留的血液；将脐带剪成1～2cm小段，再次漂洗；剖开脐带，提出脐静脉和脐动脉，将剩余的华通氏胶脐带组织剪成1～2mm³大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0.5～1.0cm，将培养瓶置于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中孵育；

(3)、第二天添加无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；

(4)、细胞传代

应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化融合度为80～90％的P0代细胞5～10min，待细胞和残余组织块悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以100μm的滤器过滤细胞，收集滤液，以1500rpm离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P1代细胞；

(5)、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化5～10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和；以1500rpm离心10min，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1～5×10⁵/mL，接种在T75培养瓶中培养；此为P2代细胞；按照此种方法，将MSCs连续传代；

(6)选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定；

二、MSCs的预处理

选取P3代细胞，在无血清完全培养基中添加咪唑喹啉R848 1～5μg/mL和重组人干扰素IFN-α-2b 100～200U/mL，继续培养24-72小时；处理后进行继续传代。

2.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一的步骤(1)中的脐带需要在8-12h内处理完毕。

3.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一的步骤(3)中的无血清完全培养基中含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。

4.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一的步骤(4)中收集过滤后残余的组织块，移入新的培养皿，间隔1-5mm种植，待其贴壁后加入无血清完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，换液；待细胞达到一定密度后传代；二次接种法培养。

5.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述步骤二中先将P3代细胞的细胞浓度调整为2×10⁵/mL～1-2×10⁴/mL。

6.如权利要求1所述的一种增强MSCs免疫调节功能的临床级别细胞制备方法，其特征在于，所述的无血清完全培养基含有病原灭活的血小板裂解液PL。