[发明专利]多功能的经血干细胞培养方法

摘要

一种多功能的经血干细胞培养方法，通过经血和血浆的采集阶段、经血的除菌清洗阶段、经血的过滤阶段、自体血浆的制备阶段、单个核细胞的分离阶段、经血干细胞的培养阶段、经血干细胞的纯化及扩增阶段和经血干细胞的冻存阶段，由此本发明一是解决了现有技术必须用高浓度的胎牛血清培养带来的各种弊端，二是用客户自己的血浆培养自己的细胞，更让其自身觉得安全且易接受，真正实现了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。

主权项

1.一种多功能的经血干细胞培养方法，其特征在于，步骤如下：步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取20‑30ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为800‑1000g/10‑15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为300‑700g/10‑15min，除去上清；步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血200‑400g/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为2～8℃的条件下保存1～7天备用或在温度为‑75～‑85℃的条件下长期保存备用；步骤5：单个核细胞的分离阶段，该阶段具体为：将步骤3中稀释的经血加入人淋巴细胞分离液之上，在温度为18‑25℃的条件下700‑1000g离心15‑20分钟；吸取中央白膜层细胞即单个核细胞，将单个核细胞吸至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心洗涤2‑3次；收集底部单个核细胞沉淀；步骤6：经血干细胞的培养阶段，该阶段具体为：用完全培养基重悬上述单个核细胞并计数，以1×106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于温度为37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，以获取经血干细胞；步骤7：经血干细胞的纯化及扩增阶段，该阶段具体为：贴壁培养所述单个核细胞，在细胞培养48‑72h后更换完全培养基以弃除未贴壁细胞，初次换液后每天观察细胞的生长情况，每2‑3天半量换液一次；步骤8：经血干细胞的冻存阶段，该阶段具体为：当扩增的经血干细胞数量达到1‑2×108细胞时，按每106‑107细胞加入0.5‑1ml冻存液，放入冻存盒采用程序降温，4℃1‑2h，‑20℃1‑2h，转入‑80℃冰箱，12～24h后转入‑196℃液氮保存备用；其中所述的步骤1和步骤2中的保存液为0.9％生理盐水或者PBS，加入相应的抗生素和抗凝剂，抗生素浓度为终浓度为0.5‑3％的青霉素和链霉素、终浓度为1‑10ug/ml的两性霉素B和肝素；其中，所述的步骤2和步骤3中的清洗液为生理盐水或者PBS，加入相应青霉素、链霉素、两性霉素B、庆大霉素，其中青霉素和链霉素为0.5‑3％的终浓度，两性霉素B为1‑10ug/ml的终浓度，庆大霉素为100‑200U/ml的终浓度；其中，所述的步骤6和步骤7中的完全培养基为基础培养基α‑MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、80U/ml庆大霉素；其中，所述步骤8中的冻存液由80％基础培养基α‑MEM，9％自体血浆，1％的氨基酸，10％的二甲基亚砜组成。