[发明专利]多功能的经血干细胞培养方法

说明书

一种多功能的经血干细胞培养方法，通过经血和血浆的采集阶段、经血的除菌清洗阶段、经血的过滤阶段、自体血浆的制备阶段、单个核细胞的分离阶段、经血干细胞的培养阶段、经血干细胞的纯化及扩增阶段和经血干细胞的冻存阶段，由此本发明一是解决了现有技术必须用高浓度的胎牛血清培养带来的各种弊端，二是用客户自己的血浆培养自己的细胞，更让其自身觉得安全且易接受，真正实现了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多功能的经血干细胞培养方法，特别涉及一种从经血中提取并培养经血干细胞的方法。

背景技术

近众所周知，子宫内膜细胞系具有很强的自我更生能力，在每个月经周期都会有组织和血管的大量增长，这一增长过程会随着月经的来临而终止继而形成经血。经血是女性血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈粘液及阴道分泌物的混杂液体。近年来，美国的研究小组和日本的研究小组利用女性经血成功分离培养出具有多向分化功能的干细胞，并将该细胞命名为子宫内膜经血源间充质干细胞其，简称经血干细胞，其扩增能力是自体骨髓干细胞的30倍，而且在神经修复、抑制肿瘤和美容抗衰老等方面具有非常显著的作用，因此有望用来治疗损伤和衰老的组织。同时经血的获得不具有侵入性不会对供者造成伤害,不仅来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题。此外，经血干细胞还具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞，因此成为寻找人类干细胞新来源及提高临床应用效果的研究热点。

由于子经血干细胞研究是近几年才开始，与之配套的培养体系还不成熟，目前体外扩增培养体系中一般都含有一定浓度的胎牛血清，使用浓度至少10％才能保证细胞的正常生长传代。然而，经血干细胞在高浓度血清培养时，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。尽管有些研究人员尝试了一些无血清培养基方案，但经血干细胞在无血清培养基中普遍存在生长缓慢，多向分化能力逐渐消失的问题，所以，急需开发一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。

发明内容

本发明的目的提供一种多功能的经血干细胞培养方法，通过经血和血浆的采集阶段、经血的除菌清洗阶段、经血的过滤阶段、自体血浆的制备阶段、单个核细胞的分离阶段、经血干细胞的培养阶段、经血干细胞的纯化及扩增阶段和经血干细胞的冻存阶段，由此本发明一是解决了现有技术必须用高浓度的胎牛血清培养带来的各种弊端，二是用客户自己的血浆培养自己的细胞，更让其自身觉得安全且易接受，真正实现了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。

为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种多功能的经血干细胞培养方法的解决方案，具体如下：

一种多功能的经血干细胞培养方法，步骤如下：

步骤1：经血和血浆的采集阶段，该阶段具体为：采用经血采集器采集经血，并将经血迅速转移到装有保存液的无菌离心管中，在温度为4℃的条件下保存，空腹抽取20-30ml静脉血置入抗凝容器里，在温度为4℃的条件下保存72h后，以此用于自体血浆的制备；

步骤2：经血的除菌清洗阶段，该阶段具体为：在48h内将浸泡在经血保存液中的经血运至实验室，将经血和保存液充分混匀，首次离心为800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混匀，再次离心为300-700g/10-15min，除去上清；

步骤3：经血的过滤阶段，该阶段具体为：将经过步骤2后所得的经血用清洗液1:1混合，充分混匀后用100μm细胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块；

步骤4：自体血浆的制备阶段，该阶段具体为：将步骤1中所抽取的静脉血200g-400g/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在温度为2～8℃的条件下保存1～7天备用或在温度为-75～-85℃的条件下长期保存备用；