[发明专利]重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白序列、制备工艺及其应用。该尿酸酶蛋白简称为JBUO，源自狒狒尿酸酶蛋白序列，并进行了人源化的突变和增强活性的突变，使其同时具有免疫原性低和催化活性高的特点。将JBUO密码子优化后，克隆到原核表达载体中，转化大肠杆菌，收获重组蛋白量可达10mg/每克干菌，同时JBUO的生物学活性大于6 IU/mg。本发明可高效、快速的获得与人体高度同源的低免疫原性的新型尿酸酶纯品，广泛用于制备治疗与人体高尿酸相关疾病的药物、食品等产品，具有极高的使用价值。

主权项

1.一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的制备方法：其特征在于：具体步骤如下：（1）、根据优化后的JBUO的核苷酸序列设计引物，需要包含酶切位点，从5`‑3`排列如下所示：JBP1：GGAATTCCATATGGCCCATTATCACAACGACTATAAGAAJBP2：CCGCTCGAGTTACAGGCGGCTACTCAGTTTGCGT引物稀释成50pmol/μl，然后进行PCR步骤；（2）、利用Tag酶进行PCR步骤，琼脂糖凝胶电泳检测JBUO条带，胶回收目的基因，用Nde I和Xho I将基因酶切成粘性末端，同样处理pET‑26b载体，加入T4 DNA 连接酶，连接后转化大肠杆菌DH5α；用硫酸卡那霉素‑LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET‑26b‑JBUO载体；（3）、将正确的pET‑26b‑JBUO质粒转化大肠杆菌BL21，用硫酸卡那霉素‑LB平板筛选出单斑克隆，在LB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中培养至OD600为0.4‑0.6，加入IPTG储液，培养后离心收集菌体，保存于‑20℃或者立即进入下步纯化；（4）、用Tris缓冲溶液洗涤混合后的菌体沉淀，用溶菌酶配合Triton X‑100帮助裂解细菌，用冰水混合物环境下超声破菌，离心后收集沉淀；（5）、用pH 10‑pH 11的Na2CO3缓冲溶液充分溶解沉淀，并加入PMSF防止蛋白酶解；再次离心后收集上清，此时所得溶液为高浓度的含有JBUO蛋白的溶液；该重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的氨基酸序列如下：MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL。