[发明专利]重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的制备方法：其特征在于：具体步骤如下：

（1）、根据优化后的JBUO的核苷酸序列设计引物，需要包含酶切位点，从5`-3`排列如下所示：

JBP1：GGAATTCCATATGGCCCATTATCACAACGACTATAAGAA

JBP2：CCGCTCGAGTTACAGGCGGCTACTCAGTTTGCGT

引物稀释成50pmol/μl，然后进行PCR步骤；

（2）、利用Tag酶进行PCR步骤，琼脂糖凝胶电泳检测JBUO条带，胶回收目的基因，用NdeI和Xho I将基因酶切成粘性末端，同样处理pET-26b载体，加入T4 DNA 连接酶，连接后转化大肠杆菌DH5α；用硫酸卡那霉素-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-26b-JBUO载体；

（3）、将正确的pET-26b-JBUO质粒转化大肠杆菌BL21，用硫酸卡那霉素-LB平板筛选出单斑克隆，在LB培养基中培养过夜，按照1:100转接，在摇瓶中培养至OD600为0.4-0.6，加入IPTG储液，培养后离心收集菌体，保存于-20℃或者立即进入下步纯化；

（4）、用Tris缓冲溶液洗涤混合后的菌体沉淀，用溶菌酶配合Triton X-100帮助裂解细菌，用冰水混合物环境下超声破菌，离心后收集沉淀；

（5）、用pH 10-pH 11的Na₂CO₃缓冲溶液充分溶解沉淀，并加入PMSF防止蛋白酶解；再次离心后收集上清，此时所得溶液为高浓度的含有JBUO蛋白的溶液；

该重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的氨基酸序列如下：

MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL。

2.一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白溶液的纯化方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、选择合适载量的阴离子交换柱，用0.1M 的pH 11的Na₂CO₃缓冲溶液平衡柱材，将含有JBUO蛋白的溶液缓慢上柱；

（2）、用0.1M的pH8.5的NaHCO₃缓冲液洗脱杂蛋白，至少清洗5倍柱材体积；然后逐渐将缓冲液的NaCl盐浓度提升到1.5M，并再清洗5倍柱材体积，充分洗脱其它杂质；

（3）、用pH11的Na₂CO₃缓冲溶液流穿柱材，并逐渐将缓冲液的NaCl盐浓度提升到1M，收集洗脱下来的JBUO蛋白；

（4）、将纯化后的JBUO蛋白上分子筛进行聚合形式鉴定，出峰位置约为140kD，为四聚体形式；

该重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白的氨基酸序列如下：

MAHYHNDYKKNDEVEFVRTGYGKDMVKVLHIQRDGKYHSIKEVATSVQLTLSSKKDYLHGDNSDIIPTDTIKNTVHVLAKFKGIKSIEAFAMNICEHFLSSFNHVIRAQVYVEEVPWKRFEKNGVKHVHAFIHTPTGTHFCEVEQMKSGPPVIHSGIKDLKVLKTTQSGFEGFIKDQFTTLPEVKDRCFATQVYCKWRYHQGRDVDFEATWDTVRDIVLKKFAGPYDKGEYSPSVQKTLYDIQVLSLSRVPEIEDMEISLPNIHYFNIDMSKMGLINKEEVLLPLDNPYGKITGTVKRKLSSRL。