[发明专利]一种免疫细胞及其制备方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种免疫细胞及其制备方法。该制备方法包括：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；贴壁细胞采用包含制剂1的培养基培养，获得DC细胞；悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；将DC细胞与杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞。本发明同时利用肿瘤细胞核苷酸和蛋白致敏源，强化刺激DC细胞，发挥更强的抗原致敏作用，达到与肿瘤细胞更高的亲和性，且不存在肿瘤细胞的危险因素。

主权项

1.一种免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；步骤2：所述贴壁细胞采用包含所述制剂1的培养基培养，培养6天后添加TNF‑α培养1~3天，获得DC细胞；所述包含制剂1的培养基的配方为添加5%~20%的制剂1、10~20ng/mL的GM‑CSF和5~10ng/mL的IL‑4的无血清培养基；步骤3：所述悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；所述诱导培养采用的培养基包括100~200U/mL IL‑2、10~20 ng/mL IL‑15、8~20 ng/mL IL‑21和40~60ng/mL OKT‑3，4天后补液；步骤4：将所述DC细胞与所述杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞；共培养采用的培养基中添加100~200U/mL IL‑2、10~20 ng/mL IL‑15，每3天补液一次；所述制剂1的制备方法为：a、肿瘤组织分离肿瘤细胞，所述肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞，1640培养基+5%血清培养，接种密度（5‑10）×105cell/mL接种于T75培养瓶；b、第二天半量换液，具体操作步骤如下：贴壁生长类肿瘤细胞：贴壁生长类肿瘤细胞待80%~90%铺满后，0.25%胰酶消化1‑2min，血清终止消化，400g离心5min沉淀细胞，1:2传代培养；根据细胞生长状况换液，并收集上清液；培养4天或8天后，收集所有上清液，0.25%胰酶消化1‑2min，血清终止消化，200~400g离心5min沉淀收集细胞；悬浮生长类肿瘤细胞：2‑3天补液一次，维持细胞密度在1‑1.5×106cell/mL，4‑8天后，收集细胞悬液，200‑400g离心5min，分别收集上清液和细胞；c、上清液采用超滤系统浓缩，步骤：培养液经0.45μm孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；再经0.22μm孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤3h去除小分子物质，得到浓缩液；d、下层细胞裂解：下层细胞加HClO4裂解、离心，取上清液；上清液加KOH中和，离心，取上清液；加活性炭吸附白细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加NaCl溶液获得肿瘤细胞核苷酸成分；e、按干重的质量比为1:1、1:5或5:1混合步骤d所得肿瘤细胞核苷酸成分和步骤c所得浓缩液获得制剂1。