[发明专利]一种免疫细胞及其制备方法

权利要求书

1.一种免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将肿瘤细胞核苷酸和上清液混合，获得制剂1；

取PBMC进行培养，分离悬浮细胞和贴壁细胞；

步骤2：所述贴壁细胞采用包含所述制剂1的培养基培养，培养6天后添加TNF-α培养1~3天，获得DC细胞；所述包含制剂1的培养基的配方为添加5%~20%的制剂1、10~20ng/mL的GM-CSF和5~10ng/mL的IL-4的无血清培养基；

步骤3：所述悬浮细胞经诱导培养，获得杀伤性免疫细胞；所述诱导培养采用的培养基包括100~200U/mL IL-2、10~20 ng/mL IL-15、8~20 ng/mL IL-21和40~60ng/mL OKT-3，4天后补液；

步骤4：将所述DC细胞与所述杀伤性免疫细胞共培养，制得免疫细胞；共培养采用的培养基中添加100~200U/mL IL-2、10~20 ng/mL IL-15，每3天补液一次；

所述制剂1的制备方法为：

a、肿瘤组织分离肿瘤细胞，所述肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞，1640培养基+5%血清培养，接种密度（5-10）×10⁵cell/mL接种于T75培养瓶；

b、第二天半量换液，具体操作步骤如下：

贴壁生长类肿瘤细胞：贴壁生长类肿瘤细胞待80%~90%铺满后，0.25%胰酶消化1-2min，血清终止消化，400g离心5min沉淀细胞，1:2传代培养；根据细胞生长状况换液，并收集上清液；培养4天或8天后，收集所有上清液，0.25%胰酶消化1-2min，血清终止消化，200~400g离心5min沉淀收集细胞；

悬浮生长类肿瘤细胞：2-3天补液一次，维持细胞密度在1-1.5×10⁶cell/mL，4-8天后，收集细胞悬液，200-400g离心5min，分别收集上清液和细胞；

c、上清液采用超滤系统浓缩，步骤：

培养液经0.45μm孔径的滤膜初滤，除去大体积杂质；

再经0.22μm孔径的滤膜再次过滤，除去小体积杂质；

得到的滤液接通Slice200切向流器，经3kd滤膜循环过滤3h去除小分子物质，得到浓缩液；

d、下层细胞裂解：

下层细胞加HClO₄裂解、离心，取上清液；

上清液加KOH中和，离心，取上清液；

加活性炭吸附白细胞内部成分，再分别加中性双蒸水和碱性溶液洗涤、抽滤、抽提，加NaCl溶液获得肿瘤细胞核苷酸成分；

e、按干重的质量比为1:1、1:5或5:1混合步骤d所得肿瘤细胞核苷酸成分和步骤c所得浓缩液获得制剂1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在共培养中，补液的密度为（1~2）×10⁶cell/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，共培养的时间至少为14天。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中PBMC的培养条件为：选用X-VIVO15无血清培养基，接种密度为（0.5~1）×10⁶ cell/mL，37℃，5%CO₂条件下培养2~4h。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，肿瘤细胞为贴壁生长类肿瘤细胞或悬浮生长类肿瘤细胞。