[发明专利]一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法

摘要

本发明公开了一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，属于微生物发酵领域。本发明方法包括如下步骤：将通过药瓶培养达到细胞干重为18～22g/L裂殖壶菌种子液接种到种子罐，培养至转接水平后，再接种到发酵罐中，采用前期高温22～33℃进行高密度培养，后期进行低温18～22℃胁迫的方式进行诱导培养110～130小时，期间通过流加葡糖糖溶液、氮源溶液和碱溶液维持发酵过程中葡糖糖、总氮含量保持一定浓度和pH在5.5～6.5区间。通过本发明方法得到的发酵液中细胞干重达到120～150g/L，DHA达到40～50g/L，比已见报道的DHA生产率高出1.2～1.5倍，非常适合应用于DHA的工业化生产。

主权项

1.一种培养裂殖壶菌高产DHA的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将裂殖壶菌ATCC20888菌种接种至装有培养基的摇瓶中，于25～35℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养20～35h；(2)将步骤(1)得到的种子液转接到装有培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5～10％，于25～30℃、150～250rpm条件下进行恒温恒转速培养16～20h，测量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L，则直接进行步骤(4)；(3)若步骤(2)得到的种子液中细胞干重没达到18～22g/L，则将其进一步转接到装有培养基的摇瓶中，按照步骤(2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L；(4)将上述细胞干重达到18～22g/L的种子液以5～10％(V/V)的接种量接种到装有培养基的种子罐中进行发酵培养；通过氨水或液碱控制发酵过程pH值维持在5.5～6.5之间，培养温度控制在25～35℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，培养至发酵液中葡萄糖耗尽，停止培养；(5)将步骤(4)种子罐中的发酵液以5～10％的接种量接种到装有培养基的发酵罐中进行发酵培养；培养温度控制在22～33℃，通气量控制在0.3～0.5vvm，通过流加葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度维持在30～50g/L，通过流加混合氮源溶液控制发酵过程中总氮浓度维持在15～25g/L，该混合氮源中包含酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠、蛋白胨中的一种或多种；通过流加氨水或液碱控制发酵过程pH维持在5.5～6.5；发酵培养至70～100h后进行低温胁迫培养，将温度降低为18～22℃，其余条件不变，继续培养30～50h；上述步骤(1)、(2)和(3)中的培养基的配方为：葡萄糖40～50g/L、酵母抽提物10～25g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L；上述步骤(4)和(5)中的培养基的配方为：葡萄糖75.0～85.0g/L、玉米浆干粉15～20g/L、酵母抽提物2.9～3.lg/L、谷氨酸钠5.0～15.0g/L、硫酸钠5.0～10.0g/L、氯化钾0.6～0.8g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、磷酸二氢钾1.9～2.lg/L、氯化钙0.14～0.16g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、四水氯化锰1.68～1.72mg/L、七水硫酸锌2.8～3.0mg/L、五水硫酸铜1.4～1.6mg/L、二水钼酸钠0～0.05mg/L、六水氯化钴0～0.05mg/L。