[发明专利]一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法

摘要

本发明公开一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，通过在库尔勒香梨花期时，采摘库尔勒香梨花丝固定在FAA液体中，更换三次FAA液体，并将装有花丝的固定液保存在4±0.5℃冰箱中，利用浸泡、包埋、修蜡块等技术制备获得样品切片，利用改良的苏木精染液对的切片进行染色，使得切片呈现黑色，并利用蒸馏水对切片进行洗色和利用氯化铝溶液对切片进行分色，从而制作永久切片，在温度为38℃‑42℃的烘箱烘烤永久切片12‑24h，直至永久切片烘干，用高倍显微镜拍照，观测库尔勒香梨花丝的细胞结构。本发明方法能够将库尔勒香梨花丝细胞的表皮细胞、花丝中层细胞和输导组织细胞清楚着色，明显区分，有立体染色效果。

主权项

一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，其特征在于，具体方法步骤如下：（1）样品固定：在库尔勒香梨花期时，从树体上采摘花丝固定在FAA液体中，第3天更换一次FAA液体，第7天再更换一次FAA液体，第15天再更换一次FAA液体，并将装有花丝的固定液保存在4±0.5℃冰箱中；所述的FAA液体为：分别配置60%酒精溶液和40%甲醛溶液，并按照体积比为60%酒精溶液:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5，将这三种液体混合，即为制备的FAA液体；（2）切片处理：取出步骤（1）FAA液体中的样品，用50%的乙醇浸洗15min，50%的乙醇浸泡1.5h，70%的乙醇浸泡1.5h，80%的乙醇浸泡1.5h，90%的乙醇浸泡1.5h，更换90%的乙醇，再次浸泡 1.5h，无水乙醇浸泡 1h，更换无水乙醇，再次浸泡 1h，无水乙醇和二甲苯混合溶液浸泡 2h，二甲苯浸泡 50 min，更换二甲苯溶液，再次浸泡 50min，二甲苯和石蜡混合溶液在 39℃恒温箱内浸泡 12h，在 62‑63℃恒温箱内石蜡溶液中浸泡，每 6 h 换一次干净的、过滤过的石蜡溶液，一共更换 3‑5 次，包埋，待纸盒内蜡液凝固后，自来水浸泡 8h，晾干，修蜡块，用石蜡切片机将库尔勒香梨花丝切成 12‑14um 厚，放到干净的载玻片上，滴水展片，40℃展片台展片 1‑2h，至蜡片完全展开，二甲苯脱蜡 10min，在二甲苯和无水乙醇的混合溶液浸泡5min，95%体积的乙醇浸泡3min，90%的乙醇浸泡3min，80%的乙醇浸泡3min，70%的乙醇浸泡3min，50%的乙醇浸泡3min，30%的乙醇浸泡3min，蒸馏水浸泡1min；所述的无水乙醇和二甲苯混合溶液：按照体积比为无水乙醇：二甲苯溶液=1:1的比例混合后的溶液；所述的二甲苯和石蜡混合溶液：按照体积比为二甲苯：石蜡溶液=1:1的比例混合后的溶液；所述的包埋为：将蜡液中的库尔勒香梨花丝连同蜡液倒到纸盒中；（3）染色：利用改良的苏木精染液对步骤（2）中处理好的切片进行染色，染色时间为20‑30min，颜色呈现黑色； 改良的苏木精染液制备为 4% 苏木精无水酒精溶液、30% 过氧化氢溶液、碘 ‑ 碘化钾溶液和10% 硫酸铝钾溶液按照体积比 20:1:15:10 进行混合，静置 1h，即为制备的改良的苏木精染液；其中碘‑碘化钾溶液制备为将30ml蒸馏水加热，加入1g碘化钾，待碘化钾充分溶解后， 再加入1g碘，静置一个星期后即可制备所得；（4）脱色：用干净的蒸馏水浸泡步骤（3）染色后的载玻片，并来回移动蒸馏水中的载玻片，直到洗净载玻片上的染色液；（5）分色：根据染色程度，用1%氯化铝溶液处理步骤（4）的载玻片30‑50s，至细胞结构清晰，再用双蒸水浸泡切片，洗去多余的1%氯化铝溶液；（6）制作永久切片：将步骤（5）分色后的载玻片按照下述步骤进行处理，制备永久切片，即步骤（5）分色后的载玻片，90%的乙醇浸泡1min，95%的乙醇浸泡1min，无水乙醇浸泡3min，无水乙醇和二甲苯的混合溶液浸泡 10min，二甲苯浸泡 5min，更换二甲苯溶液，再次浸泡5min，中性树胶封片，制作成永久切片；所述的无水乙醇和二甲苯混合溶液：按照体积比无水乙醇：二甲苯溶液为1:1的比例混合后的溶液；（7）光学显微镜拍照和观测：在温度为38℃‑42℃的烘箱烘烤步骤（6）制备的永久切片12‑24h，直至永久切片烘干，用高倍显微镜拍照，并观测库尔勒香梨花丝的细胞结构。