[发明专利]一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法

权利要求书

1.一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法，其特征在于，具体方法步骤如下：

（1）样品固定：在库尔勒香梨花期时，从树体上采摘花丝固定在FAA液体中，第3天更换一次FAA液体，第7天再更换一次FAA液体，第15天再更换一次FAA液体，并将装有花丝的固定液保存在4±0.5℃冰箱中；

所述的FAA液体为：分别配置60%酒精溶液和40%甲醛溶液，并按照体积比为60%酒精溶液:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5，将这三种液体混合，即为制备的FAA液体；

（2）切片处理：取出步骤（1）FAA液体中的样品，用50%的乙醇浸洗15min，50%的乙醇浸泡1.5h，70%的乙醇浸泡1.5h，80%的乙醇浸泡1.5h，90%的乙醇浸泡1.5h，更换90%的乙醇，再次浸泡 1.5h，无水乙醇浸泡 1h，更换无水乙醇，再次浸泡 1h，无水乙醇和二甲苯混合溶液浸泡 2h，二甲苯浸泡 50 min，更换二甲苯溶液，再次浸泡 50min，二甲苯和石蜡混合溶液在 39℃恒温箱内浸泡 12h，在 62-63℃恒温箱内石蜡溶液中浸泡，每 6 h 换一次干净的、过滤过的石蜡溶液，一共更换 3-5 次，包埋，待纸盒内蜡液凝固后，自来水浸泡 8h，晾干，修蜡块，用石蜡切片机将库尔勒香梨花丝切成 12-14um 厚，放到干净的载玻片上，滴水展片，40℃展片台展片 1-2h，至蜡片完全展开，二甲苯脱蜡 10min，在二甲苯和无水乙醇的混合溶液浸泡5min，95%体积的乙醇浸泡3min，90%的乙醇浸泡3min，80%的乙醇浸泡3min，70%的乙醇浸泡3min，50%的乙醇浸泡3min，30%的乙醇浸泡3min，蒸馏水浸泡1min；

所述的无水乙醇和二甲苯混合溶液：按照体积比为无水乙醇：二甲苯溶液=1:1的比例混合后的溶液；

所述的二甲苯和石蜡混合溶液：按照体积比为二甲苯：石蜡溶液=1:1的比例混合后的溶液；

所述的包埋为：将蜡液中的库尔勒香梨花丝连同蜡液倒到纸盒中；

（3）染色：利用改良的苏木精染液对步骤（2）中处理好的切片进行染色，染色时间为20-30min，颜色呈现黑色； 改良的苏木精染液制备为 4% 苏木精无水酒精溶液、30% 过氧化氢溶液、碘 - 碘化钾溶液和10% 硫酸铝钾溶液按照体积比 20:1:15:10 进行混合，静置 1h，即为制备的改良的苏木精染液；其中碘-碘化钾溶液制备为将30ml蒸馏水加热，加入1g碘化钾，待碘化钾充分溶解后， 再加入1g碘，静置一个星期后即可制备所得；

（4）脱色：用干净的蒸馏水浸泡步骤（3）染色后的载玻片，并来回移动蒸馏水中的载玻片，直到洗净载玻片上的染色液；

（5）分色：根据染色程度，用1%氯化铝溶液处理步骤（4）的载玻片30-50s，至细胞结构清晰，再用双蒸水浸泡切片，洗去多余的1%氯化铝溶液；

（6）制作永久切片：将步骤（5）分色后的载玻片按照下述步骤进行处理，制备永久切片，即步骤（5）分色后的载玻片，90%的乙醇浸泡1min，95%的乙醇浸泡1min，无水乙醇浸泡3min，无水乙醇和二甲苯的混合溶液浸泡 10min，二甲苯浸泡 5min，更换二甲苯溶液，再次浸泡5min，中性树胶封片，制作成永久切片；

所述的无水乙醇和二甲苯混合溶液：按照体积比无水乙醇：二甲苯溶液为1:1的比例混合后的溶液；

（7）光学显微镜拍照和观测：在温度为38℃-42℃的烘箱烘烤步骤（6）制备的永久切片12-24h，直至永久切片烘干，用高倍显微镜拍照，并观测库尔勒香梨花丝的细胞结构。

2.如权利要求1所述的一种库尔勒香梨花丝细胞立体染色方法在库尔勒香梨花丝细胞染色中的应用。