[发明专利]快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒

摘要

本发明提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，包括四重PCR反应体系，包含针对引起小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌基因的正、反向引物和AllGlo荧光探针。本发明设计合理，可简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体的感染，实现了单管PCR同时检测四种细菌，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，并可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，对阻断传染源、减少四种细菌感染或混合感染、监测临床疗效均有很大的临床实用性。

主权项

1.一种联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，其特征在于：由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成，其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及含Mg2+的qPCR反应缓冲液、四种dNTP、Hot Start Taq DNA聚合酶构成的混合液，强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl；所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：HI：上游引物：GATGCTGGTGTATTTGGTGG下游引物：CCGTTCAACTTGGGCTTTAG探针：SAT‑AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG‑SATSP：上游引物：CATTTGGTGATGCGGCTA下游引物：AGGACGGCTTTCGTTGAG探针：MAR‑CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT‑MARMC：上游引物：ATCTATGCCAACTGGAAGCC下游引物：CCAACACGGAAATCACGAC探针：JUP‑CTATCGCCCACACACTCAGCGTG‑JUPLP：上游引物：TCGTCACTTAAACGGCTTC下游引物：TACCGACCAGGATTGCTAC探针：NEP‑CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG‑NEPSAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素；HI标准品序列：GATGCTGGTG TATTTGGTGG AAAAACTGAC TTGAGTGCTA TCAACTTAAA TTTAAGTGGT GCTTATCGAG TAACAGAAGG TTTGAGCCTA GGTTTAGGGG TAAATGCGGT TTATGCTAAA GCCCAAGTTG AACGGSP标准品序列：CATTTGGTGA TGCGGCTAAA GGTAAAACAA TTGCAGCCGC ACAATACGCA GCCGGTGCAG ATATTGTTTA CCAAGTAGCT GGTGGTACAG GTGCAGGTGT CTTTGCAGAG GCAAAATCTC TCAACGAAAG CCGTCCTMC标准品序列：ATCTATGCCA ACTGGAAGCC TTATGGCAAT GATAAGGTGA ATGTAAACTT TGCGGTGAAT AATGTCTTTA ATAAAAACTA TCGCCCACAC ACTCAGCGTG CTTCCATAGA TACCTTACCT GGGGCAGGTC GTGATTTCCG TGTTGGLP标准品序列：TCGTCACTTA AACGGCTTCT TTCTAGATAA CTTCAATTCC AAATTCAATG GATTTGGTCC CCGTACCGGC CTTGATATGA ATTATGTATT CGGTAATGGG TTTGGTATTT ATGCAAAATC AGCTGTAGCA ATCCTGGTCG GTA；其中：强、弱阳性质控品为由流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）和嗜肺军团菌（LP）等量混合的阳性质粒样品，阴性质控品为灭菌注射用水；所述5个阳性定量标准品是由HI、SP、MC、LP等量混合的质粒样品，浓度分别为103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl。