[发明专利]快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒

说明书

本发明提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，包括四重PCR反应体系，包含针对引起小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌基因的正、反向引物和AllGlo荧光探针。本发明设计合理，可简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体的感染，实现了单管PCR同时检测四种细菌，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，并可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，对阻断传染源、减少四种细菌感染或混合感染、监测临床疗效均有很大的临床实用性。

技术领域

本发明属于生物技术，涉及一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，尤其涉及检测流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenzae,HI）、肺炎链球菌（Streptococcus Pneumoniae,SP）、卡他莫拉菌（Moraxella Catarrhalis,MC）、嗜肺军团菌（Legionella Pneumophila, LP）的四重定量PCR试剂盒，具体地说，本发明涉及应用四重定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四种细菌（HI、SP、MC、LP）的试剂盒。

背景技术

根据世界卫生组织（WHO）统计，肺炎是全球儿童的“头号杀手”，也是5岁以下儿童死亡的第二位原因。在我国，儿童肺炎亦是儿童期重要的常见疾病，在儿童患病率、病死率中占据第一，用于治疗肺炎的巨大医疗费用加重了社会和患儿家庭的经济负担。近年来随着抗生素、激素及免疫抑制剂的广泛应用，呼吸道防御功能及机体免疫力降低，人体寄生菌与宿主之间的关系发生了变化，同时耐药菌的出现也进一步加重了疾病负担。

分析研究显示中国5岁以下死于肺炎的儿童中，感染肺炎链球菌和b型流感嗜血杆菌的占到54.2%。肺炎链球菌（SP）和流感嗜血杆菌（HI）常与正常菌群共生，是儿童社区获得性肺炎的重要致病菌，通常起病急骤，以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征，主要经呼吸道传播，好发于冬春季。卡他莫拉菌（MC）是引起儿童肺炎的第三位常见致病菌，仅次于前两者，其发病率有逐年增加趋势，且令人担忧的是已发现产β-内酰胺酶菌株占分离菌90%以上，给临床治疗带来困难。MC产生的β-内酰胺酶不仅保护着细菌产生的各种致病性的酶，而且使得其他严重呼吸道合并感染如SP、HI感染对青霉素治疗无效。嗜肺军团菌（LP）感染引起的肺炎，其临床表现多样，X线胸片改变缺乏特异性，可能合并肺外多脏器损害。军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最严重的一种，未经有效治疗者的病死率高达45%。以上四种细菌感染引起的肺炎，其症状、体征及X线检查结果不易鉴别和鉴定，因此快速同步对小儿细菌性肺炎四种临床难鉴定病原体（HI、SP、MC、LP）进行联合检测及鉴别诊断意义重大。

细菌性肺炎的临床表现复杂多样、不典型，容易误诊和漏诊，为了早期明确病因诊断，及早采取快速、有效的治疗，一个敏感而可靠的实验室诊断技术是必需的。HI、SP、MC、LP感染引起的肺炎临床对其病原学诊断主要依靠细菌学检查。痰细菌培养仍是常规检测项目，细菌培养阳性是诊断的金标准，具有一定的临床价值，但其生长缓慢、培养耗时长，技术要求高，从临床样本中进行分离培养较困难并且难鉴定，易混淆而造成误诊，尤其在混合感染中，可能会忽视一些潜在的病原菌，因而限制了其在临床的应用。另外，虽然血清学方法技术成熟，有商品试剂盒供应，但是敏感性和特异性有待提高，同时，需要检测急性期和恢复期双份血清才有诊断意义且容易漏诊。

定量PCR检测方法是目前众多研究的焦点，优点是快速简便、准确可靠、敏感性高、特异性强、可以定量、不受抗生素应用的影响等。由此基础上发展而来的多重定量PCR在儿童肺炎病原体联合检测及鉴别诊断中变得越来越重要。因此，迫切需要单管PCR同时定量检测以上4种临床难培养鉴定细菌的感染或混合感染的试剂盒。其不仅快速准确、节约成本，还可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，为临床治疗方案的制定提供参考依据，从而提高临床决策水平，有效降低抗生素的过度使用，监测临床疗效，并最终改善患者预后。

发明内容