[发明专利]一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法

摘要

本发明公开了一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法。利用金华猪泌乳期21天乳腺组织进行原代培养、传代培养最终获得高纯度、高活率的金华猪乳腺上皮细胞系，此乳腺细胞系属于生物学领域。培养得到的乳腺细胞系不含成纤维细胞等杂细胞，细胞纯度高；冻存细胞质量稳定，经过细胞冻存复苏后活率可达90%，细胞传代后生长稳定，适合大规模培养。经过细胞学特性的检测，表明该细胞系符合细胞系建系要求。本发明涉及的金华猪乳腺上皮细胞可以用于制作转基因猪的核移植供体；可以为医学及分子生物学研究提供原材料；农业上可以丰富和改良地方猪种，是我国地方优良猪种的有效保护手段。

主权项

一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法，其特性在于它的步骤如下：1）原代培养从泌乳21天金华猪乳腺中剪取乳腺样品，用含有青霉素和链霉素的PBS清洗样品3~4次，然后剪成0.5~1.0mm³的组织块；将组织块移入50ml离心管中，加入等比例的胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ混合消化液消化乳腺组织两小时，将消化液过滤于100目细胞筛，收集过滤液，并转移至15ml高压灭菌离心管中 1000rpm离心细胞5min，倒掉消化液，留取底部的细胞团，用PBS洗三次，加入5ml包含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞团使之均匀悬浮，最后放入37℃以及体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养；待细胞长出后，观察细胞生长情况，利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同，对乳腺上皮细胞进行纯化；2）传代培养倒出步骤1）过程中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化细胞后加入10~15ml的培养液终止消化；消化后的细胞平均分成三瓶，放入37℃，5%CO₂的培养箱中培养；3）细胞冻存（1）准备冻存前24~26h弃除原有培养液并更换新的培养液10~15ml，继续培养24~26h;（2）倒出培养瓶中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；（3）1000rpm离心细胞5min，去上清，加入1~1.5ml的冻存液，吹打细胞使其悬浮; 冻存液成分：体积百分数为50%胎牛血清、体积百分数为40%DMEM及体积百分数为10%DMSO；（4）将细胞及冻存液转移到冻存管中，用封口膜封口； (5)将装有细胞的冻存管转移到4℃冰箱中放置1~2h，然后转入‑20℃冰箱中放置2~3h，再移入到‑70℃的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存，并做好相应的记录;4）细胞复苏(1) 将冻存管从液氮中取出后迅速放入37~39℃水浴锅中融化，晃动1~2min;(2) 把细胞移入到加入了10~15ml 全培养基离心管中，1000r/min离心5min;(3) 去上清，加入2ml的培养基，将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶，放置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养。