[发明专利]一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法

权利要求书

1.一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法，其特性在于它的步骤如下：

1）原代培养

从泌乳21天金华猪乳腺中剪取乳腺样品，用含有青霉素和链霉素的PBS清洗样品3~4次，然后剪成0.5~1.0mm³的组织块；将组织块移入50ml离心管中，加入等比例的胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ混合消化液消化乳腺组织两小时，将消化液过滤于100目细胞筛，收集过滤液，并转移至15ml高压灭菌离心管中 1000rpm离心细胞5min，倒掉消化液，留取底部的细胞团，用PBS洗三次，加入5ml包含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液，吹打细胞团使之均匀悬浮，最后放入37℃以及体积百分数为5%CO₂的培养箱中培养；待细胞长出后，观察细胞生长情况，利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同，对乳腺上皮细胞进行纯化；

2）传代培养

倒出步骤1）过程中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用体积分数为0.25%的胰蛋白酶消化细胞后加入10~15ml的培养液终止消化；消化后的细胞平均分成三瓶，放入37℃，5%CO₂的培养箱中培养；

3）细胞冻存

（1）准备冻存前24~26h弃除原有培养液并更换新的培养液10~15ml，继续培养24~26h;

（2）倒出培养瓶中的培养液，用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；

（3）1000rpm离心细胞5min，去上清，加入1~1.5ml的冻存液，吹打细胞使其悬浮; 冻存液成分：体积百分数为50%胎牛血清、体积百分数为40%DMEM及体积百分数为10%DMSO；

（4）将细胞及冻存液转移到冻存管中，用封口膜封口；

 (5)将装有细胞的冻存管转移到4℃冰箱中放置1~2h，然后转入-20℃冰箱中放置2~3h，再移入到-70℃的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存，并做好相应的记录;

4）细胞复苏

(1) 将冻存管从液氮中取出后迅速放入37~39℃水浴锅中融化，晃动1~2min;

(2) 把细胞移入到加入了10~15ml 全培养基离心管中，1000r/min离心5min;

(3) 去上清，加入2ml的培养基，将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶，放置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法，其特征在于所述步骤2)的胰蛋白酶消化的步骤为：向培养瓶中加入37~39℃预热的质量百分数为0.25%的胰蛋白酶1.5~2ml，在显微镜下观察体积百分数为90%的细胞变成圆形后将胰蛋白酶倒掉，用手拍打细胞培养瓶，使细胞脱落，加入10~15ml新的培养液。

3.根据权利要求1所述的一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法，其特征在于所述的步骤3)中的细胞冻存的步骤为：弃除原有培养液并更换新的培养液继续培养24~26h；用PBS清洗2~3次后，用胰蛋白酶消化后加入10~15ml的培养液终止消化；1000rpm离心细胞5min，去上清，加入1~1.5ml的冻存液，吹打细胞使其悬浮；将细胞及冻存液转移到冻存管中，用封口膜封口；将装有细胞的冻存管转移到4℃冰箱中放置1~2h，然后转入-20℃冰箱中放置2~3h，再移入到-70℃的冰箱中过夜，最后快速将其移入到液氮中长期保存。

4. 根据权利要求1所述的一种金华猪乳腺上皮细胞系的培养方法，其特征在于所述的步骤4)中的细胞复苏的步骤为：将冻存管从液氮中取出后迅速放入37~39℃水浴锅中融化，晃动1~2min后，把细胞移入到加入了10~15ml 全培养基离心管中，1000r/min离心5min后去上清，加入2ml的培养基，将细胞轻轻吹打均匀后将细胞移入有培养液的培养瓶，放置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养。