[发明专利]一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法

摘要

本发明提供了一种新型的基于金纳米簇的增强型甲胎蛋白荧光传感器。以巯基化合物为表面修饰剂制备的金纳米簇，具有良好的荧光性质。在KMnO4或H2O2的氧化作用下，金纳米簇的荧光发生猝灭；如果向猝灭的金纳米簇中加入还原性物质如对氨基苯酚、抗坏血酸、邻苯二酚，荧光则重新得到恢复。利用碱性磷酸酶(ALP)能够催化其底物坏血酸磷酸三钠盐或对氨基苯磷酸盐或邻苯二酚磷酸酯分解生成对氨基苯酚、抗坏血酸、邻苯二酚，以ALP为标记物实现信号放大作用，建立了一种新型、高灵敏的针对甲胎蛋白的免疫传感器。本方法具有操作便捷、灵敏度高与选择性好等优点，为构建基于金属纳米簇的新型免疫荧光传感器提供了借鉴。

主权项

一种非诊断目的的基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白的免疫测定方法，其特征在于：a、将一定量的HAuCl4与修饰剂混合并用NaOH调节pH至碱性，37℃下搅拌反应24h，得到金纳米簇用超纯水透析12h作为荧光探针；b、通过Au纳米粒子的层状CaCO3微粒固定碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗，形成CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物，作为信号标签诱导检测信号的产生；CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物的制备方法如下：一定量的柠檬酸三钠盐与氯金酸混合后，煮沸搅拌一段时间，冷却得到Au纳米粒子；一定量的吐温‑80，氯化钙和碳酸钠混合并超声，离心得到层状CaCO3微粒；将CaCO3微粒分散于Au纳米粒子中超声，离心得到CaCO3‑Au纳米粒子复合物；将一定量的甲胎蛋白二抗，碱性磷酸酶和CaCO3‑Au纳米粒子复合物混合震荡2h，再加入一定的牛血清白蛋白封闭，30min后离心并重新分散，得到CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物；c、将30μL 0.5mg/mL的甲胎蛋白一抗加入到微孔板中，4℃下过夜后用含有0.05％吐温‑20的pH＝7.4的Tris‑HCl缓冲液作为洗涤液洗涤，并用含有3％(w/v)牛血清白蛋白的pH＝7.4的Tris‑HCl溶液作为封闭液封闭30min，然后将不同浓度的甲胎蛋白抗原加入到微孔板中，37℃条件下反应1h；在一抗与抗原特异性结合后，加入CaCO3‑Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物反应1h，洗涤移除多余的生物复合物；最后，向微孔板中加入50μL 0.1mol/L的碱性磷酸酶的催化底物溶液和50μL pH＝9.1的Tris‑HCl缓冲液，反应25min后加入猝灭剂与金纳米簇形成的混合液；反应5min后测定荧光强度。