[发明专利]一种基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白免疫测定方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白的免疫测定方法，其特征在于：

a、将一定量的HAuCl₄与修饰剂混合并用NaOH调节pH至碱性，37℃下搅拌反应24h，得到金纳米簇用超纯水透析12h作为荧光探针；

b、通过Au纳米粒子的层状CaCO₃微粒固定碱性磷酸酶和甲胎蛋白二抗，形成CaCO₃-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物，作为信号标签诱导检测信号的产生；CaCO₃-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物的制备方法如下：一定量的柠檬酸三钠盐与氯金酸混合后，煮沸搅拌一段时间，冷却得到Au纳米粒子；一定量的吐温-80，氯化钙和碳酸钠混合并超声，离心得到层状CaCO₃微粒；将CaCO₃微粒分散于Au纳米粒子中超声，离心得到CaCO₃-Au纳米粒子复合物；将一定量的甲胎蛋白二抗，碱性磷酸酶和CaCO₃-Au纳米粒子复合物混合震荡2h，再加入一定的牛血清白蛋白封闭，30min后离心并重新分散，得到CaCO₃-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物；

c、将30μL 0.5mg/mL的甲胎蛋白一抗加入到微孔板中，4℃下过夜后用含有0.05％吐温-20的pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液作为洗涤液洗涤，并用含有3％(w/v)牛血清白蛋白的pH＝7.4的Tris-HCl溶液作为封闭液封闭30min，然后将不同浓度的甲胎蛋白抗原加入到微孔板中，37℃条件下反应1h；在一抗与抗原特异性结合后，加入CaCO₃-Au纳米粒子/二抗/碱性磷酸酶生物复合物反应1h，洗涤移除多余的生物复合物；最后，向微孔板中加入50μL 0.1mol/L的碱性磷酸酶的催化底物溶液和50μL pH＝9.1的Tris-HCl缓冲液，反应25min后加入猝灭剂与金纳米簇形成的混合液；反应5min后测定荧光强度。

2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白的免疫测定方法，其特征在于所述的金纳米簇合成时使用的修饰剂为带有巯基且能够稳定纳米簇的化合物，所述修饰剂选自牛血清白蛋白、还原性谷胱甘肽、2,3-二巯基丁二酸、嘌呤；修饰剂的物质的量与氯金酸的物质的量之比为1/20–1/5。

3.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白的免疫测定方法，其特征在于碱性磷酸酶的催化底物选自抗坏血酸磷酸三钠盐、对氨基苯磷酸盐、邻苯二酚磷酸酯。

4.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的基于金纳米簇的荧光增强型甲胎蛋白的免疫测定方法，其特征在于加入的金纳米簇的猝灭剂选自高锰酸钾、双氧水，猝灭剂的量为金纳米簇的量的1/1000-1/1。