[发明专利]羊口疮病毒毒力基因VIR缺失突变株及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种羊口疮病毒毒力基因VIR缺失突变株及其制备方法和应用，制备方法，采用PCR方法克隆包含ORFV‑SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，用酶切方法缺失掉VIR毒力基因，在缺失位点插入带有痘苗病毒晚期启动子P11和LacZ报告基因的表达盒，构建以LacZ基因为筛选标记的重组穿梭载体；将重组穿梭载体转染到ORFV感染的Vero细胞中进行同源重组，经蚀斑筛选纯化获得VIR毒力基因缺失的重组病毒ORFV‑ΔVIR‑LacZ。本发明借助基因工程手段快速降低ORFV毒力，为ORF疫苗的研发提供技术支撑，具有生产周期短、不需要驯化、操作方便快捷等特点，可以被广泛应用。

主权项

一种羊口疮病毒毒力基因VIR缺失突变株的制备方法，具体步骤如下：A、采用PCR方法克隆包含ORFV‑SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，用酶切方法缺失掉VIR毒力基因，在缺失位点插入带有痘苗病毒晚期启动子P11和LacZ报告基因的表达盒，构建以LacZ基因为筛选标记的重组穿梭载体；B、将重组穿梭载体转染到ORFV感染的Vero细胞中进行同源重组，经蚀斑筛选纯化获得VIR毒力基因缺失的重组病毒ORFV‑ΔVIR‑LacZ；步骤A所述的包含ORFV‑SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，制取方法用病毒提取试剂盒提取ORFV‑SHZ1株基因组DNA，用P1‑P2引物扩增出含VIR毒力基因及上下臂的序列，回收PCR扩增产物，将其与pMD18‑T‑simple载体连接，获得pVIR重组质粒，其中：P1的序列为：5’‑ATCGTGAACACCAAGACCT‑3’,P2的序列为：5’‑TTGTGCACGCTGCGCGC‑3’；所述步骤A中酶切方法缺失掉VIR毒力基因的操作为：用Sph I和BglII双酶切pVIR重组质粒，对VIR基因进行缺失突变；所述步骤A中带有痘苗病毒晚期启动子P11和LacZ报告基因的表达盒采用限制性内切酶XbaI从pSC‑11穿梭载体上切下含有痘苗病毒晚期启动子P11和报告基因lacZ的基因片段；步骤B中的蚀斑筛选纯化采用DMEM原液对同源重组毒稀释，接种Vero细胞，无菌挖取蓝斑，反复冻融，重新接种Vero细胞，待出现细胞病变和蓝斑后，连续接种Vero细胞，得到纯化的重组病毒ORFV‑ΔVIR‑LacZ。