[发明专利]羊口疮病毒毒力基因VIR缺失突变株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程用于兽医生物技术领域，具体涉及一种羊口疮病毒弱毒疫苗及其制备方法。

背景技术

羊口疮亦称羊传染性脓疱(Contagious Ecthyma，CE)、接触传染性脓疱皮炎(Contagious pustular dermatitis，CPD)、羊传染性脓疮(Ecthyma Contagiosum)等，是由羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)所引起的一种绵羊和山羊的接触性传染病，在临床上以口唇、舌、鼻、乳房等皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、结节、水疱、脓疱、溃疡和疣状厚痂为特征。该病通过直接接触传染，以3～6月龄的羔羊最易感，常呈群发性流行；鹿、骆驼、麝牛、人也可感染。该病在在养羊集中的国家和地区广泛流行，给养羊业造成了较严重的经济损失。

疫苗接种是防控该病的主要手段，常规的ORF灭活苗和弱毒苗在预防该病的发生和流行过程中起到一定作用，它能在一定程度上降低疾病的感染率，但现有的常规疫苗也存在一定的缺陷。ORF灭活苗是用物理的或化学的方法将ORFV灭活，使其丧失感染性和繁殖能力，这种疫苗虽然安全性高、稳定性强，但由于在灭活过程中病毒的抗原性发生的一定的改变，免疫期较短，免疫效果不够理想，且主要诱导机体的体液免疫应答，不能诱导特异性的细胞免疫。

弱毒疫苗是将ORFV强毒株通过细胞连续传代进行人工驯化获得减毒毒株，其优点是免疫原性强，可诱导机体产生坚强的体液和细胞免疫，免疫力较为持久。如CN201110452835.7公开了一种山羊口疮病毒毒力弱化方法，利用犊牛睾丸细胞系，通过羊口疮病毒的连续传代培养，致使羊口疮病毒毒力致弱，为羊口疮病毒弱毒疫苗制备生产提供了稳定可靠的方法，用以获得大量的稳定的疫苗。但其缺点是研发周期长，驯化难度高，很难在短时间得到免疫原性理想的减毒毒株。近年来，随着ORFV病毒变异株的出现，现有ORF疫苗使其不能提供完全保护，从而导致羊传染性脓疱病的频繁暴发。因此有必要借助具有突出优势的技术手段研究快速降低ORFV毒力的方法，为ORF疫苗的研发提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的是针对现有人工驯化羊口疮病毒弱毒株周期长、免疫原性易发生改变等缺点，采用基因工程方法通过对羊口疮病毒毒力基因VIR(interferon resistance gene，干扰素抗性因子)进行缺失以实现其毒力快速降低，提供一种制备毒力显著降低但仍保持良好的免疫原性的弱毒疫苗制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来实施的：

一种羊口疮病毒毒力基因VIR缺失突变株的制备方法，具体步骤如下：

A、采用PCR方法克隆包含ORFV-SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，用酶切方法缺失掉VIR毒力基因，在缺失位点插入带有痘苗病毒晚期启动子P11和LacZ报告基因的表达盒，构建以LacZ基因为筛选标记的重组穿梭载体；

B、将重组穿梭载体转染到ORFV感染的Vero细胞中进行同源重组，经蚀斑筛选纯化获得VIR毒力基因缺失的重组病毒ORFV-ΔVIR-LacZ。

所述ORFV-SHZ1株VIR毒力基因的序列如SED ID NO.1所示。

步骤A所述的包含ORFV-SHZ1株VIR毒力基因及侧翼序列的基因片段，制取时优选方法用病毒提取试剂盒提取ORFV-SHZ1株基因组DNA，用P1-P2引物扩增出含VIR毒力基因及上下臂的序列，回收PCR扩增产物，将其与pMD18-T-simple载体连接，获得pVIR重组质粒，其中：

P1的序列为：5’-ATCGTGAACACCAAGACCT-3’,

P2的序列为：5’-TTGTGCACGCTGCGCGC-3’。

所述引物P1序列如SED ID NO.2所示、引物P2序列如SED ID NO.2所示。

所述VIR基因上下同源臂的基因序列如SED ID NO.4所示。

所述步骤A中酶切方法缺失掉VIR毒力基因的优选操作为：用Sph I和BglII(629-827bp)双酶切pVIR重组质粒，对VIR基因进行缺失突变。

所述步骤A中带有痘苗病毒晚期启动子P11和LacZ报告基因的表达盒采用限制性内切酶XbaI从pSC-11穿梭载体上切下含有痘苗病毒晚期启动子P11和报告基因lacZ的基因片段。