[发明专利]高效分离脐带间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供了一种高效分离脐带间充质干细胞的方法。本发明直接从脐带内分离华通氏胶，避免了杂细胞的污染，无需多次传代，保证了细胞的纯度和活力；能有效的减少脐带分离过程的污染，且能降低分离的成本。在分离过程中不需要机械破碎脐带，减少机械剪切力对细胞的损害，获得的细胞活率更高；由于在分离过程中未采用异种消化酶和异种血清，所以所得到的细胞不含异种蛋白，也更安全，可以满足临床使用的需要，也为建立脐带间充质干细胞库提供了技术保障；采用组织块法的方法，更加方便和快捷，对细胞损伤小，能最大可能的保护间充质干细胞，不受损伤，使其具有更高活率。

主权项

一种高效分离脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：1) 华通氏胶的分离：将采集瓶中采集液倒出，仅保留脐带在采集瓶中；加入质量百分比为75%的酒精将脐带完全浸没，并浸泡2分钟；再将脐带转移到培养皿中，用生理盐水清洗2次，直至脐带表面不含血迹；将清洗过的脐带两端去除，并去除动脉血管、静脉血管和羊膜，分离出华通氏胶，放入培养皿中用生理盐水清洗；清洗完成后将华通氏胶剪成1‑4mm³的小块,并转移至50ml离心管中；2）将剪碎的华通氏胶接种到2个T‑75培养瓶中，每瓶不少于1.0g，再向每个培养瓶中加入9ml完全培养基，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；3）换液：每5天换液一次，直至达到60–70%的融合率；然后将培养基分别倒入50ml离心管中，并标记，在2000rpm下离心5分钟，去除上清；向每个离心管中加入9ml新鲜的完全培养基，并充分混合均匀；将培养基从50ml离心管中转移到原来的培养瓶中，并在培养瓶上标记换液日期；将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每4‑5天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到60%‑70%融合时进行收集；4）传代：将用过的培养基收集到50ml离心管中，在2000rpm下离心5分钟；再用10‑20 ml 的生理盐水清洗T‑75培养瓶1次；向清洗后的每个T‑75培养瓶中加入3ml预热到室温的质量百分比为0.125%的胰酶；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用静置后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下2分钟；将离心管中剩余组织块倒入1个新的T‑75培养瓶中，加入8ml完全培养基作为备份；用10‑20 ml 的生理盐水清洗一遍T‑75培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中；用细胞滤器过滤细胞悬液去除细胞组织块；将过滤好的细胞悬液收集到一个新的50ml离心管中；取0.5ml过滤后的细胞悬液计数，测活力；根据计数和活力结果，按照8×10³/cm²‑1×10⁴/cm²的接种密度选择T‑175培养瓶或T‑75培养瓶；将需要的细胞300g离心10分钟，去除上清；在离心管中加入5ml的完全培养基吹散细胞，再加入20ml完全培养基充分混匀；将细胞悬液接种细胞到1个T‑175培养瓶中，将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO₂培养箱中培养；每天在显微镜下观察生长情况，当细胞达到80%‑90%融合时进行收集；5）收集：将用过的培养基收集到50ml离心管中，将收集的培养基300g离心5分钟；用20 ml 的生理盐水清洗T‑175培养瓶1次，并向每瓶加入6ml预热过的质量百分比为0.125%的胰酶，在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程室温条件下2分钟；将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中；用20 ml 的生理盐水清洗一遍T‑175培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中，并将洗液300g离心10分钟；6）冻存: 用5ml完全培养基稀释细胞团块，再加入20ml培养基混合均匀；从细胞悬液中取1‑2滴进行细胞计数和活力测定，活力需达到85%以上，细胞数达到8x10⁸以上，取流式，流式检测细胞数需达到2x10⁶；将300g细胞悬液离心5min；在收集到的细胞团中加入2ml 完全培养基、并打散，再加入2ml  4℃预冷30分钟的含质量百分比20%的DMSO的冻存液，并混合均匀；将4ml细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1.3ml，每管的细胞数为 2x10⁶；最后利用程序降温盒或程控降温仪冻存细胞。