[发明专利]高效分离脐带间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种高效分离脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞 (mesenchyma1 stem cells ，MSC_S) 是来源于发育早期中胚层和外 胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现，因其具有以下特点；1 造血支持作用。作为造血微环境主要细胞成分－基质细胞系的干/祖细胞,MSC_S与造血干细胞共同移植可促进 造血干祖细胞的植入。 2免疫调控。MSC_S不表达 CD80 ，CD86 ，HLA-DR 等协同剌激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主 病，治疗自身免疫系统疾病有重要意义。3基因治疗。由于 MSC_S体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，加之MSC具有对肿瘤的靶向性，在肿瘤的基因治疗中有着十分诱人的前景。4 多向分化潜能。在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌脏、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多 向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程。

脐带是连接胎儿与胎盘问的索状结构，外被羊膜包围，内含茹液性的结缔组织，该结缔组织内有脐动脉和脐静脉。血管周围被乳蛋白样组织所包裹，后者被称为华通氏胶 (Wharton S jelly) ，它富含透明质酸，形成了成纤维细胞周围的水凝胶结构。目前己有众多研究组从脐带中分离出能形成成纤维细胞集落形成单位 (CFU-F)的细胞，这些细胞符合国际细胞治疗协会 (The Internationa1   Society for Ce11u1ar Therapy，ISCT) 制定的 最低标准【 Cytotherapy(2006)Vo1.8，No.4，315-317 】; (1)贴壁(塑料材质培养器皿)生长能力；(2)细胞表型：应该表达的一类表型 CD73 、CD90 和 CD105 必须阳性，阳性率不低于 95%; 同时为了确保 MSC  中没有混杂原代分离培养物中存在的一些细胞，选取一组己去口的 MSC不表达的表型做为辅助的排查标准， CD34 (造血祖细胞和内皮细胞标记)、 CD45 (白细胞标记)、 CD14/CDllb   (单核细胞和巨噬细胞标记)、CD79α/CD19   (B 细胞标记)和 HLA-DR  阴性，阳性 率不高于 2% ; (3) 多向分化潜能，包括向骨、软骨、脂肪分化的能力。

目前的研究结果显示，脐带组织中的问充质干细胞主要分布在:①脐带血管周围，从人脐带血管内皮和内皮下分离出形态学和免疫表型类似于 BM-MSC 的细胞，并表现出多向分化潜能;②华通氏胶 (Wharton' s Je11y)，在华通氏胶中发现了一种细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。这两种细胞均为间充质干细胞，同样具有多向分化能力，同样具有免疫调节洁性。

目前，己经有多个单位申请了脐带间充质干细胞分离的专利，这些专利从脐带中获得间充质干细胞的方法多为用胶原酶或混合酶消化而获得或者是组织块贴壁法。这些方法的一个共同特点是需要将脐带组织通过机械力破碎。由于产妇大部分生产方式为顺产，在生产过程中，尤其是顺产过程中会导致脐带外 表携带细菌等微生物。虽然在分离脐带间充质干细胞过程前会对脐带进行清洗，但这并不 能完全去除脐带表面携带的细菌等微生物，在机械力破碎脐带的过程会导致分离的细胞被 污染。目前，国内外己经建立了多个脐带间充质干细胞库，对每个保存脐带间充质干细胞的储户来说，干细胞资源是独一无二的，细胞污染是很难被接受的，所以开发新的工艺迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是：提供一种高效分离脐带间充质干细胞的方法，它对细胞损伤小，能更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞。

本发明是这样实现的：高效分离脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1) 华通氏胶的分离：将采集瓶中采集液倒出，仅保留脐带在采集瓶中；加入质量百分比为75%的酒精将脐带完全浸没，并浸泡2分钟；再将脐带转移到培养皿中，用生理盐水清洗2次，直至脐带表面不含血迹；将清洗过的脐带两端去除，并去除动脉血管、静脉血管和羊膜，分离出华通氏胶，放入培养皿中用生理盐水清洗；清洗完成后将华通氏胶剪成1-4mm³的小块,并转移至50ml离心管中；