[发明专利]一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法

摘要

本发明公开了一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，该方法包括(1)培养容器灭菌；(2)外植体的获得及灭菌处理；(3)浅层培养的外植体的制备；(4)浅层培养；(A)丛生芽诱导；(B)微球茎形成；浅层培养阶段又分丛生芽诱导和微球茎形成两个过程。由于浅层培养采用的液体培养模式，培养体更易吸收培养基中的营养成分，所以种苗生长快，缩短了微球茎生产时间；同时浅层培养操作简单，成本低，更容易实现规模化和工业化生产。

主权项

一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养容器灭菌：将培养基放入培养容器中，并在高温高压湿热消毒灭菌后待用；(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗20～40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成0.5～1.0cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，获得藏红花愈伤组织；所述藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；(4)浅层培养：(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm3小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，培养时间为15～25d；(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基，培养时间为30～45d；即获得藏红花丛生微球茎；所述步骤(2)中的灭菌处理的具体步骤为：首先在75％无水乙醇中浸泡15～30s，再用无菌水清洗2～4次，然后放入摩尔浓度为0.1％的升汞中浸泡3～5min，再用无菌水清洗5～8次；所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基的配方为：MS+0.5～1.5mg/L 6‑BA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.6～6.0，培养时间为25～30d；所述步骤(4)中的(A)步骤中的液体培养基的配方为：MS+1.5～2.5mg/L 6‑BA+0.05～0.15mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖20g/L+AC0.1～0.3g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基倒入组培瓶中，液面高度为0.2～0.5cm，灭菌后使用；所述步骤(4)中的(B)步骤中的液体培养基的配方为：1/2MS+0.1～0.5mg/L IBA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖30g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基灭菌后倒入组培瓶中，液面高度为0.5～1.0cm。