[发明专利]一种利用浅层培养生产藏红花微球茎方法

权利要求书

1.一种利用浅层培养生产藏红花微球茎的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养容器灭菌：将培养基放入培养容器中，并在高温高压湿热消毒灭菌后待用；

(2)外植体的获得及灭菌处理：将藏红花球茎放入含有消毒液的水中培养待其长出叶片，取下叶片，清水冲洗20～40分钟；在超净台中将上述藏红花叶片进行表面消毒灭菌处理；

(3)浅层培养的外植体的制备：将步骤(2)中已消毒灭菌的叶片在无菌环境下切成0.5～1.0cm的小段，并接种到已灭菌的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基中，获得藏红花愈伤组织；所述藏红花愈伤组织即为浅层培养的外植体；

(4)浅层培养：

(A)丛生芽诱导：将步骤(3)中获得的愈伤组织切成0.1～0.3cm³小块接种到液体浅层丛生芽诱导培养基中培养，培养时间为15～25d；

(B)微球茎形成：丛生芽诱导结束后，不移动组培苗及培养基，直接向组培瓶中添加诱导微球茎形成的培养基，培养时间为30～45d；即获得藏红花丛生微球茎。

2.根据权利要求1所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(2)中的灭菌处理的具体步骤为：首先在75％无水乙醇中浸泡15～30s，再用无菌水清洗2～4次，然后放入摩尔浓度为0.1％的升汞中浸泡3～5min，再用无菌水清洗5～8次。

3.根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织的固体培养基的配方为：MS+0.5～1.5mg/L 6-BA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖25g/L+琼脂5.5g/L，pH为5.6～6.0，培养时间为25～30d。

4.根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(A)步骤中的液体培养基的配方为：MS+1.5～2.5mg/L 6-BA+0.05～0.15mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖20g/L+AC 0.1～0.3g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基倒入组培瓶中，液面高度为0.2～0.5cm，灭菌后使用。

5.根据权利要求2所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(B)步骤中的液体培养基的配方为：1/2MS+0.1～0.5mg/L IBA+0.05～0.2mg/L NAA+藏红花汁液0.1～0.3g/L+蔗糖30g/L，pH为5.6～6.0，将配制好的液体培养基灭菌后倒入组培瓶中，液面高度为0.5～1.0cm。

6.根据权利要求5所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(3)中的诱导藏红花愈伤组织培养的环境为：暗培养30～40d，温度为19～22℃。

7.根据权利要求6所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(A)步骤中丛生芽生长的培养环境为：首先进行暗培养，暗培养时间为10～15d；然后进行光照培养，光照周期14h/d，光照强度1800～2000LX，培养时间为5～10d；所述培养环境温度为19～22℃。

8.根据权利要求7所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述步骤(4)中的(B)步骤中微球茎产生的培养环境为：光照周期14h/d，光照强度2000～2500LX，温度18～20℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述藏红花汁液的制备方法是鲜物研磨或榨汁。

10.根据权利要求9所述的利用浅层培养生产藏红花微球茎方法，其特征在于，所述藏红花汁液的制作步骤为：将藏红花球茎洗净，除去皮膜，切成质量为1～5g的小块，研钵研磨获得所述汁液。