[发明专利]一种北冬虫夏草的规模化培育方法

摘要

本发明公开了一种北冬虫夏草的规模化培育方法，通过野生北冬虫夏草为出发菌株，经分离、提纯培养，用制做液体的北冬虫夏草菌种，将液体菌种接种到健康、没有发育的柞蚕蛹体上，经盒式栽培或瓶式栽培获得北冬虫夏草。本发明解决了现有人工栽培北冬虫夏草出现僵化率低、出草低、不齐等的技术问题。 1

主权项

1.一种北冬虫夏草的规模化培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1 北冬虫夏草一级、二级母种斜面培养

步骤1.1 配置培养基，培养基配方为：土豆200g、琼脂20g、柞蚕蛹100g、葡萄糖20g、蛋白胨8g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.75g，1000毫升水；

步骤1.2 采集野生北冬虫夏草用质量浓度0.1％的汞溶液消毒，无菌水清洗，取其内部组织1立方毫米的小块移接至培养基斜面，放入20℃的恒温箱中培养15天即得北冬虫夏草一级母种斜面；

步骤1.3 选择僵化率高、出草整齐的一级母种斜面试管再进行扩大培养，得二级母种斜面；

步骤2 北冬虫夏草液体菌种的制作与培养

步骤2.1 配置培养基，按质量分数培养基配方为：活柞蚕蛹10％、葡萄糖1％、蛋白胨1％、速溶奶粉1％、磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.075g，1000ml水，1只鸡蛋清；

步骤2.2 接种二级母种，在21℃恒温箱内静止培养24h后，用150r/min往复式摇床进行振荡培养96h后，选取合格菌种；

步骤3 注射接种

选取蚕蛹在发酵终了前1d进行注射接种，注入菌种0.08～0.15ml，送发菌室内发菌；

步骤4 菌丝培养

步骤4.1 低温避光环境下培养，温度前3d控制为16℃，3d～8d控制为18℃，湿度60％以上；

步骤4.2 将僵化好的蚕蛹21～22℃避光条件下培养，促使菌丝后熟，转向生殖生长阶段；

步骤5 诱导原基形成与出草管理

步骤5.1 将生殖生长阶段的僵蛹的三分之一处划刀口，划口后的僵蛹不立即见光，在温度21～22℃，湿度80％以上的暗室培养中3天，待僵蛹的环节及划口处长出白色菌丝，再装瓶见光出草；

步骤5.2 将菌丝营养生长结束的蚕蛹，用2g/L臭氧水蛹体表面消毒10min，控净表面自由水后在无菌室上瓶，送到出草室培养出草；

步骤5.3 待原基形成后温度控制在19～22℃，蛹虫草长到1cm高时，将室内的相对湿度调高至75％～80％，经过15～17d，蛹虫草生长高度接近瓶口即可采收。

2.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草的规模化培育方法，其特征在于：步骤1.1所述的培养基通过以下方法制备：将土豆块和柞蚕蛹加水煮沸至土豆软而不烂时，滤去土豆残渣，在汁液中加入剩余组分并搅拌均匀，加热至琼脂完全溶化后分装试管，培养基的量与试管的体积比是1∶5，高压锅灭菌，加热到压力达到0.5Kg/m²时，排出冷空气，然后继续加热至125℃时保压35分钟后停止加热降温，排气，并趁热把试管摆成斜面，得固体试管斜面备用。

3.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草的规模化培育方法，其特征在于：步骤2.1所述的培养基通过以下方法制备：将活蚕蛹手撕开放入1000ml冷水中，沸煮25min，收集滤液，开水定溶1000ml，依次加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨和奶粉，充分溶解后，冷却至30℃，加入泡沫鸡蛋清，充分搅拌均匀，高压灭菌器，在0.137Mpa、125℃条件下灭菌20min，滤出澄清液，加入葡萄糖搅拌溶解后灭菌。

4.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草的规模化培育方法，其特征在于：步骤2.2所述的合格菌种标准为：菌液澄清不混浊，菌球多，形状一致，发育齐一，晃动后浮起的菌球5min不下沉，经显微镜检查，无和虫草菌丝不一样的微生物。

5.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草的规模化培育方法，其特征在于：步骤3所述的发菌室在使用前3d用3％甲醛进行消毒，室外过道用1％消特灵水洗刷封闭地面，发菌室的门窗用黑红布窗帘遮挡。

6.根据权利要求1所述的一种北冬虫夏草的规模化培育方法，其特征在于：所述的生殖生长的标志为：菌龄达15～17d；蛹体和环节间膜处长出白色菌丝；蛹顶由白色变成淡褐色。