[发明专利]一种不育系快速转育方法

摘要

本发明公开了一种不育系快速转育方法，即通过体细胞杂交和分子标记选择相结合的方法快速转育不育系。属于作物育种技术领域。首先，分离供体（不育）胞质和受体（可育）原生质体；然后，用碘乙酰胺（IOA）处理受体原生质体使其细胞质失活，再按2:1(v/v)的比例混合供体胞质和受体原生质体，采用电融合法或化学融合法使供、受体融合；最后，在适合的培养条件下使融合体再生，选择与受体基因型、表现型一致的不育再生植株，用受体花粉授粉后正常结实的即为受体不育系。

主权项

1.一种不育系快速转育方法，其特征在于：材料选择、酶解和离心，得到原生质体；然后通过对受体的有效钝化、融合，获得胞质融合体；融合体的培养和再生，最后，通过形态学和分子标记选择获得不育系再生植株；具体包含以下步骤：（1）供受体的原生质体的分离：1) 材料：培养50‑80天的烟草无菌苗；2) 酶解：1%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.6mol/L甘露醇+0.1%MES的酶液组合，在25‑28℃下酶解，离心；3）原生质体：0.6mol/L甘露醇+15%、30%、45%蔗糖梯度，离心获得原生质体；（2）非对称融合技术：1）钝化：0.1mM IOA处理受体后离心；2）化学融合：在25～30℃下，40%的PEG融合20～25min；3）电融合：第一步和第三步的融合参数为：交流电压U' 和U" 为1.5V，持续时间t1和t3为40s；第二步的融合参数为：脉冲电压U∏为50V，脉冲持续时间t2为50μs，融合脉冲次数n为2；（3）融合体的培养和再生：1）融合体的培养：以 DPD培养基外加1.0 mg/L 2,4‑D + 0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6‑BA 培养，50%以上融合体开始分裂后加入新鲜培养基KM8P，此后每周加入渗透压减半的新鲜培养基KM8P；2）愈伤的增殖和分化：增殖培养：1/2MS+IBA+KT，分化培养基：MS+IAA+KT；所述的增殖培养基：1/2MS+2.5 mg/L IBA+ 1.5 mg/L KT，分化培养基：MS+0.25 mg/L IAA+2.0 mg/L KT；（4）不育系的鉴定筛选：1）基因型：SSR、ISSR分子标记鉴定；2）表现型：与受体表现性状一致，但不育，能接受受体和其他烟草材料的花粉而结实；3）倍性：气孔保卫细胞叶绿体计数法。