[发明专利]一种不育系快速转育方法

说明书

本发明公开了一种不育系快速转育方法，即通过体细胞杂交和分子标记选择相结合的方法快速转育不育系。属于作物育种技术领域。首先，分离供体（不育）胞质和受体（可育）原生质体；然后，用碘乙酰胺（IOA）处理受体原生质体使其细胞质失活，再按2:1(v/v)的比例混合供体胞质和受体原生质体，采用电融合法或化学融合法使供、受体融合；最后，在适合的培养条件下使融合体再生，选择与受体基因型、表现型一致的不育再生植株，用受体花粉授粉后正常结实的即为受体不育系。

技术领域

本发明涉及一种快速的不育系转育方法，通过体细胞杂交技术和分子标记选择技术相结合的方法快速转育不育系，属于作物育种技术领域。

背景技术

利用雄性不育系制种，可以省去人工去雄这一环节，既节省劳力，又能提高制种质量，降低种子生产成本，还具有较强的知识产权保护功能。雄性不育性受细胞质控制，转育容易。目前，在生产上应用的雄性不育系大多都是经人工转育获得。传统的不育系转育方法是回交转育法，此法简单，易操作。通过已有的雄性不育系(非轮回亲本)和需转育成不育系的材料(轮回亲本)杂交和连续回交5－7代，每代定向选择与轮回亲本性状一致的不育系，一般至少需3-4年才能获的与轮回亲本一样的稳定不育系。传统的不育系转育方法和技术存在的问题：1、周期长。如果一年两季，也至少需3-4年。2、成本高。杂交一次，回交5－7代，每代定向选择，需较大的人力、物力。近年来，也报道了许多快速获得雄性不育系的方法，如利用分子标记辅助选择回交后代，也大大减少回交代数和种植样本数，节省了劳力和成本，但也至少需2-3年。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种快速的不育系转育方法，通过体细胞杂交技术和分子标记选择技术相结合的方法快速转育不育，以解决现有技术存在的问题。

本发明的技术方案是：一种不育系快速转育方法，材料选择、酶解和离心，得到原生质体和胞质分离；然后通过对供、受体的有效钝化、融合，获得胞质融合体；融合体的培养和再生，最后，通过形态学和分子标记选择获得不育系再生植株。

一种不育系快速转育方法，包含以下步骤：

(1)供受体的原生质体的分离

1)材料：培养50-80天的烟草无菌苗；

2)酶解：1％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.6mol/L甘露醇+0.1％MES的酶液组合，在25-28℃下酶解，离心；

3)胞质体：0.6mol/L甘露醇+15％、30％、45％蔗糖梯度，离心获得胞质体；

(2)非对称融合技术

1)钝化：0.1mM IOA处理受体后离心；

2)化学融合：在25～30℃下,40％的PEG融合20～25min；

3)电融合：以①U’～1.5V；t1:40s；②U_∏50V；t2:50μs；n2和③U”～1.5V；t3:40s的参数融合；

(3)融合体的培养和再生

1)融合体的培养：以DPD培养基培养，50％以上融合体开始分裂后加入新鲜培养基KM8P，此后每周加入渗透压减半的新鲜培养基KM8P；

2)愈伤的增值和分化：增值培养基：1/2MS+2.5mg/L IBA+1.5mg/L KT，分化培养基：MS+0.25mg/LIAA+2.0mg/LKT；

(4)不育系的鉴定筛选

1)基因型：SSR、ISSR分子标记鉴定；

2)表现型：与受体表现性状一致，但不育，能接受受体和其他烟草材料的花粉而结实；

3)倍性：气孔保卫细胞叶绿体计数法。