[发明专利]用于在作物中确定供体插入的快速靶向分析

摘要

本公开提供了用于检测和鉴定含有精确靶向的基因组座位的植物事件，和包含这种被靶向的基因组座位的植物和植物细胞的方法。该方法可以用作高通量处理，用于筛选被靶向基因组座位的供体DNA多核苷酸插入。这些方法可以容易地应用于鉴定通过使用位点特异性核酸酶的靶向方法产生的植物事件。

主权项

1.一种用于检测通过基因组靶位点内的锌指核酸酶核酸切割以及包含多核苷酸供体序列的供体质粒所介导的多核苷酸供体序列的位点特异性整合的方法，该方法包括：a.使用设计为结合基因组DNA靶位点的第一外‑PCR引物和设计为结合整合的多核苷酸供体序列的第一内‑PCR引物，通过第一轮PCR扩增基因组DNA而产生第一扩增子，其中所述第一内‑PCR引物以低于第一外‑PCR引物的浓度提供，且其中所述第一外‑PCR引物及所述第一内‑PCR引物对被选择为仅扩增以反方向插入的多核苷酸供体序列，其中所述反方向是相对原转化载体的方向而言的；b.使用特异性针对位于第一扩增子内的序列的引物，通过第二轮PCR扩增第一扩增子而产生第二扩增子；和c.检测第二扩增子的存在，其中第二扩增子的产生指示位点特异性整合事件的存在。