[发明专利]用于在作物中确定供体插入的快速靶向分析

权利要求书

1.一种用于检测通过基因组靶位点内的锌指核酸酶核酸切割以及包含多核苷酸供体序列的供体质粒所介导的多核苷酸供体序列的位点特异性整合的方法，该方法包括：

a.使用设计为结合基因组DNA靶位点的第一外-PCR引物和设计为结合整合的多核苷酸供体序列的第一内-PCR引物，通过第一轮PCR扩增基因组DNA而产生第一扩增子，其中所述第一内-PCR引物以低于第一外-PCR引物的浓度提供，且其中所述第一外-PCR引物及所述第一内-PCR引物对被选择为仅扩增以反方向插入的多核苷酸供体序列，其中所述反方向是相对原转化载体的方向而言的；

b.使用特异性针对位于第一扩增子内的序列的引物，通过第二轮PCR扩增第一扩增子而产生第二扩增子；和

c.检测第二扩增子的存在，其中第二扩增子的产生指示位点特异性整合事件的存在。

2.权利要求1的方法，其中所述基因组靶位点包括内源的或工程化的基因组靶位点。

3.权利要求1的方法，其中实施第一轮PCR所使用的第一外-PCR引物与第一内-PCR引物的相对浓度为约4:1、3:1或2:1。

4.权利要求1的方法，其中第一内-PCR引物包含0.05–0.09μM的浓度，且第一外-PCR引物包含至少0.1μM的浓度。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中第二轮PCR包括设计为结合第一扩增子的基因组DNA靶位点的第二外-PCR引物，和设计为结合第一扩增子的整合的多核苷酸供体序列的第二内-PCR引物。

6.权利要求5的方法，其中第二内-PCR引物以低于第二外-PCR引物的浓度提供。

7.权利要求5的方法，其中实施第二轮PCR所使用的第二外-PCR引物与第二内-PCR引物的相对浓度为约4:1、3:1或2:1。

8.权利要求5的方法，其中第二内-PCR引物包含0.05–0.1μM的浓度，且第二外-PCR引物包含0.2μM的浓度。

9.权利要求1的方法，其中包含基因组靶位点内多核苷酸供体序列的位点特异性整合的基因组DNA是植物基因组DNA。

10.权利要求9的方法，其中该植物基因组DNA是从单子叶植物分离的。

11.权利要求9的方法，其中该植物基因组DNA是从双子叶植物分离的。

12.权利要求9的方法，其中基因组靶位点内多核苷酸供体序列的位点特异性整合是通过用位点特异性核酸酶切割基因组DNA靶位点而产生的。

13.权利要求12的方法，其中基因组靶位点内多核苷酸供体序列的位点特异性整合是通过非同源末端连接机制发生的。

14.权利要求1的方法，其中检测步骤包括在凝胶中对第二扩增子进行电泳。

15.权利要求1的方法，其中检测步骤包括对第二扩增子进行测序。