[发明专利]一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法

摘要

本发明公开了一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法，本发明的方法通过对培养基改良，在培养基中添加海洋天然物质，对样品浓缩以增加单位体积微生物含量以及控制筛选条件等途径，从我国东海海域约600m水深获得的海洋淤泥中筛选得到产低温中性蛋白酶菌株，最高粗酶酶活达35.5U/ml。

主权项

一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备上清液：将深海淤泥加到质量百分比为0.85%的生理盐水中，深海淤泥和生理盐水的体积比为1:10~20，得到第一悬浮液；漏斗过滤后再使用真空抽滤器过滤，得到的上清液经121℃高温蒸汽灭菌15min；（2）制备初筛培养基、斜面培养基和发酵培养基；以质量比计，初筛培养基中包括2.0%的干酪素和1.5%的琼脂，余量为步骤1制备的上清液，pH为7.0；斜面培养基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的琼脂，余量为步骤1制备的上清液，pH为7.0；发酵培养基中包括4.0%的麸皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na₂HPO₄·12H₂O和0.03%的KH₂PO₄，余量为步骤1制备的上清液，pH为7.0；（3）菌液浓缩：将深海淤泥加到质量百分比为0.85%的生理盐水中，深海淤泥和生理盐水的体积比为1:5~10，得到第二悬浮液，使用漏斗过滤，得到的上清液置于18~22℃培养箱中培养4~6小时，得到浓缩后的菌液；（4）菌株初筛：将步骤3浓缩后的菌液加到质量百分比为0.85%的无菌生理盐水中，按照10倍梯度稀释法稀释6次，分别取各稀释梯度的菌液置于步骤2制备的初筛培养基中，20~25℃下培养24~72小时；挑取透明圈大的菌株，在步骤2中制备的斜面培养基中保存；（5）菌种复筛：将初筛得到的菌种按体积比1%的接种量接种到发酵培养基中，20℃，200rpm培养48h；得到的发酵液在8000r/min冷冻离心机中4℃离心15min，得到上清液即为粗酶液；以干酪素为底物，用福林酚法测定粗酶液酶活，进一步挑选出产酶能力强的菌株。