[发明专利]一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产酶微生物的筛选方法，尤其涉及一种从深海淤泥中筛选得到产低温中性蛋白酶的菌株的方法。

技术背景

深海环境由于终年低温，存在一个低温的生态系统，包括多种低温动物和微生物。深海低温微生物经过长期的进化适应，有着适应低温环境的特殊结构与代谢机制，他们产生的酶在低温环境下有着比中温酶更高的催化效率，从而能够大幅度节约能源，在食品、洗涤剂、化妆品和水产饲料等工业上，有着较高的开发利用价值。蛋白酶是目前应用最多的一种酶，但所用的基本是中温酶，其最适酶活温度在50℃左右，而低温蛋白酶的最适酶活温度基本都在40℃以下，而且酶的最适产酶温度都在25℃左右。世界上也有相关实验室从事低温蛋白酶的研究，目前已从海水、嗜冷的鱼类和贝类以及高山、南北极泥土等样品中分离到产低温蛋白酶的菌株。有关深海微生物资源的勘探和代谢活性物质研究，已成为国际上极端微生物研究的热点之一，我国的一些研究机构也积极开展低温蛋白酶生产菌株的筛选工作。

微生物筛选时由于采集样品中的微生物数量较少，通常通过富集培养增加目标微生物的数量，但富集后样品中微生物多样性降低，富集培养效果不一致，呈现极好极坏两极化状态。本发明中将菌液浓缩，从而增加单位体积内微生物数量，确保筛选效果。同时，在培养基制备时投其所好，将海洋淤泥的上清液灭菌后代替双蒸水制备培养基，确保菌株的正常生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、易实施、效果好的从深海淤泥中筛选产低温中性蛋白酶菌种的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种产低温中性蛋白酶菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备上清液：将深海淤泥加到质量百分比为0.85%的生理盐水中，深海淤泥和生理盐水的体积比为1:10~20，得到第一悬浮液；漏斗过滤后再使用真空抽滤器过滤，得到的上清液经121℃高温蒸汽灭菌15min；

（2）制备初筛培养基、斜面培养基和发酵培养基；以质量比计，初筛培养基中包括2.0%的干酪素和1.5%的琼脂，余量为步骤1制备的上清液，pH为7.0；斜面培养基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的琼脂，余量为步骤1制备的上清液，pH为7.0；发酵培养基中包括4.0%的麸皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na₂HPO₄·12H₂O和0.03%的KH₂PO₄，余量为步骤1制备的上清液，pH为7.0；

（3）菌液浓缩：将深海淤泥加到质量百分比为0.85%的生理盐水中，深海淤泥和生理盐水的体积比为1:5~10，得到第二悬浮液，使用漏斗过滤，得到的上清液置于18~22℃培养箱中培养4~6小时，得到浓缩后的菌液；

（4）菌株初筛：将步骤3浓缩后的菌液加到质量百分比为0.85%的无菌生理盐水中，按照10倍梯度稀释法稀释6次，分别取各稀释梯度的菌液置于步骤2制备的初筛培养基中，20~25℃下培养24~72小时；挑取透明圈大的菌株，在步骤2中制备的斜面培养基中保存；

（5）菌种复筛：将初筛得到的菌种按体积比1%的接种量接种到发酵培养基中，20℃，200rpm培养48h；得到的发酵液在8000r/min冷冻离心机中4℃离心15min，得到上清液即为粗酶液；以干酪素为底物，用福林酚法测定粗酶液酶活，进一步挑选出产酶能力强的菌株。

    本发明的有益效果是，本发明的方法通过对培养基改良，在培养基中添加海洋天然物质，对样品浓缩以增加单位体积微生物含量以及控制筛选条件等途径，从我国东海海域约600m水深获得的海洋淤泥中筛选得到产低温中性蛋白酶菌株，最高粗酶酶活达35.5U/ml。

具体实施方式

实施例1

初筛培养基制备：将取自深海的淤泥10g加到100ml双蒸水中制成悬浮液，摇匀。先使用漏斗过滤再使用真空抽滤器过滤。将上清液经121℃高压蒸汽灭菌15min后替代双蒸水用于制备培养基。初筛培养基：干酪素2.0%，琼脂1.5%，pH 7.0。斜面培养基：胰蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，NaCl 1.0%，琼脂1.5%，pH 7.0。发酵培养基：麸皮4.0%，蛋白胨0.1%，Na₂HPO₄·12H₂O0.4%，KH₂PO₄0.03%，pH7.0。