[发明专利]通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法

摘要

本发明涉及通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法。目前促进骨髓间充质干细胞软骨向分化的方法在进行在体培养之前，需要大量的外源性生长因子和体外培养操作。本发明将传代培养至P3代的骨髓间充质干细胞与软骨细胞及细胞外基质大聚集体（细胞砖）混合，重悬于富血小板血浆，制备骨髓间充质干细胞-细胞砖-富血小板血浆细胞复合体，逐渐凝结时，将其注射于裸鼠背部皮下，经培养获得新生组织工程软骨。本发明在骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养方法的基础上，获得完全生物性的、可注射的组织工程软骨，能够稳定维持BMSCs软骨向分化，有效抑制体内肥大化，解决了背景技术中的不足。

主权项

通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：由以下步骤实现：步骤一：软骨细胞及细胞外基质大聚集体的制备：（1）软骨细胞分离，成膜培养：取1月龄新西兰白兔的入耳软骨，剪碎后用质量分数为0.2%的II型胶原酶溶液在37^○C温度下消化12小时，之后，取单细胞悬液于15ml 离心管内以1000rpm的转速离心5min；弃去上清，PBS冲洗1次，以1000rpm转速离心5min，利用成膜诱导液重悬细胞，以6.5×10⁵个细胞/cm²的浓度种植于6孔板中培养，之后每3天换一次液，培养液即前述成膜诱导液；（2）软骨细胞膜片细胞砖化处理：10天后，软骨细胞成膜，将软骨细胞膜片刮下，浸入盛有质量分数为1.2%的褐藻酸钠溶液的培养皿中铺平，滴入102mM的氯化钙溶液直至褐藻酸钠溶液完全凝结为胶冻状复合体，厚度为3‑5mm；用多片刀先横后纵切割胶冻状复合体，并将其浸于藻酸盐溶解缓冲液中，释放获得细胞砖；PBS冲洗两次，备用；步骤二：富血小板血浆提取：取2月龄新西兰白兔耳缘静脉血，按总体积的10%加入质量分数为3.8%的柠檬酸钠溶液抗凝，采用两步离心法制备富血小板血浆；步骤三：骨髓间充质干细胞‑细胞砖‑富血小板血浆细胞复合体制备与注射：将传代培养至P3代的骨髓间充质干细胞和细胞砖重悬于500ul富血小板血浆中，其中，骨髓间充质干细胞数量为2.25×10⁷个，细胞砖中初始细胞数量为7.5×10⁶个；混匀后加入溶有50ul凝血酶的氯化钙溶液中，氯化钙溶液质量体积分数为100mg/ml，得到细胞复合体；将此细胞复合体转移至2ml注射器内， 1分钟后，细胞复合体逐渐凝结时，将其注射于裸鼠背部皮下，经过12周体内培养，获得新生组织工程软骨。