[发明专利]通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法

权利要求书

1.通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：软骨细胞及细胞外基质大聚集体的制备：

（1）软骨细胞分离，成膜培养：

取1月龄新西兰白兔的入耳软骨，剪碎后用质量分数为0.2%的II型胶原酶溶液在37^○C温度下消化12小时，之后，取单细胞悬液于15ml 离心管内以1000rpm的转速离心5min；

弃去上清，PBS冲洗1次，以1000rpm转速离心5min，利用成膜诱导液重悬细胞，以6.5×10⁵个细胞/cm²的浓度种植于6孔板中培养，之后每3天换一次液，培养液即前述成膜诱导液；

（2）软骨细胞膜片细胞砖化处理：

10天后，软骨细胞成膜，将软骨细胞膜片刮下，浸入盛有质量分数为1.2%的褐藻酸钠溶液的培养皿中铺平，滴入102mM的氯化钙溶液直至褐藻酸钠溶液完全凝结为胶冻状复合体，厚度为3-5mm；

用多片刀先横后纵切割胶冻状复合体，并将其浸于藻酸盐溶解缓冲液中，释放获得细胞砖；PBS冲洗两次，备用；

步骤二：富血小板血浆提取：

取2月龄新西兰白兔耳缘静脉血，按总体积的10%加入质量分数为3.8%的柠檬酸钠溶液抗凝，采用两步离心法制备富血小板血浆；

步骤三：骨髓间充质干细胞-细胞砖-富血小板血浆细胞复合体制备与注射：

将传代培养至P3代的骨髓间充质干细胞和细胞砖重悬于500ul富血小板血浆中，其中，骨髓间充质干细胞数量为2.25×10⁷个，细胞砖中初始细胞数量为7.5×10⁶个；

混匀后加入溶有50ul凝血酶的氯化钙溶液中，氯化钙溶液质量体积分数为100mg/ml，得到细胞复合体；

将此细胞复合体转移至2ml注射器内， 1分钟后，细胞复合体逐渐凝结时，将其注射于裸鼠背部皮下，经过12周体内培养，获得新生组织工程软骨。

2.根据权利要求1所述的通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：

步骤一（1）中，成膜诱导液为高糖DMEM培养基，包含20%胎牛血清、272ug/ml谷氨酰胺、50ug/ml抗坏血酸、50ug/ml青霉素、30ug/ml链霉素，余量为水。

3.根据权利要求2所述的通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：

步骤一（2）中，藻酸盐溶解缓冲液包含55mM柠檬酸钠，0.15mM氯化钠，余量为水，pH6.8。

4.根据权利要求3所述的通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：

步骤一（2）中，多刀片的刀片间距离为1mm。

5.根据权利要求4所述的通过定向诱导骨髓间充质干细胞获得组织工程软骨的方法，其特征在于：

步骤二中，两步离心法制备富血小板血浆由以下步骤实现：

全血室温1800rpm转速离心8分钟后，分为上中下三层，上层为乏血小板血浆，中层为富血小板血浆，下层为红细胞；

转移上中两层血浆于另一新的离心管中3600rpm转速离心8分钟，弃去上层3/4的乏血小板血浆，余下部分用滴管将血小板反复吹打均匀，即为富血小板血浆，血小板终浓度为20.9±1.1×10⁸/ml，置于冰上保存备用。