[发明专利]一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突变体的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突变体的方法，采用特异性的反转录引物，提高反转录效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，较短时间内快速检测出BCR/ABL融合基因及其不同剪切突变体，为疾病的早期诊断及靶向治疗提供依据。

主权项

一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其不同剪接突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)A液：特异性逆转录引物引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀释混匀，浓度为2.5pmol/μl(引物序列见表1)；B液：巢式第一轮PCR反应液500μl(20测试)：包含引物为：BCR‑1、BCR‑3、ABL‑1、E2A‑1、E2A‑3；(引物序列见表2)第一轮多重PCR引物100pmol/条，缓冲体系为：Tris‑HCL(PH8.3)8.8MM、KCL 44MM、dNTPs 0.16MM/each、MgCL2 1.32MM，储存于‑20℃，备用。C液：巢式第二轮PCR反应液500μl(20测试)：包含引物为：BCR‑2、BCR‑4、ABL‑2、E2A‑2、E2A‑4；(引物序列见表2)各组第二轮多重PCR引物125pmol/条，反应缓冲体系为：Tris‑HCL(PH 8.3)9.6MM、KCL 48mm、dNTPs 0.192MM/each、MgCL2 1.44MM，储存于‑20℃，备用。D液：阴性对照(阳性内对照)健康人外周血单个核细胞cDNA溶液；E液：阳性对照‑BCR/ABL b3a2阳性K562细胞系cDNA溶液；F液：阳性对照‑BCR/ABL e1a2阳性患者cDNA溶液；G液：阳性对照‑BCR/ABL b2a2阳性患者cDNA溶液；(2)采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因(E2A)的mRNA作为阳性内对照；(3)巢式第一轮PCR(25μl体系)：各取患者cDNA、阴性对照D液和阳性对照E液2μl，各取B液22μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(1.25U)，PCR条件为：95℃5min后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环，结束反应；(4)巢式第二轮PCR(25μl体系)：各取C液22μl，相应的第1轮PCR产物2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(1.25U)。PCR反应条件同第一轮。