[发明专利]一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪切突变体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液病分子生物学领域，尤其涉及一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因及其剪接突变体的方法。

背景技术

慢性粒细胞白血病是造血组织的恶性肿瘤，BCR/ABL融合基因及其不同突变体的检测是该病诊断、病情监测、预后及指导治疗的一个关键指标。目前的检测方式很难同时检测该基因的不同突变体，大多只能检测其中一个基因，且检出率低，耗费时间较长。

因此，现有技术有待于改进。

发明内容

本发明为了解决现有技术的不足，提供一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，采用多重巢式PCR方法，短时间内快速检测出BCR/ABL融合基因及其不同突变体。

为解决上述技术问题，本发明实施例提供的一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，采用如下技术方案：

一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)A液：特异性逆转录引物

引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀释混匀，浓度为2.5pmol/μl；

B液：巢式第一轮PCR反应液500μl(20测试)：

包含引物为：BCR-1、BCR-3、ABL-1、E2A-1、E2A-3；

第一轮多重PCR引物100pmol/条，缓冲体系为：Tris-HCL(PH8.3)8.8MM、KCL 44MM、dNTPs 0.16MM/each、MgCL₂1.32MM。储存于-20℃，备用；

C液：巢式第二轮PCR反应液500μl(20测试)：

包含引物为：BCR-2、BCR-4、ABL-2、E2A-2、E2A-4；

各组第二轮多重PCR引物125pmol/条，反应缓冲体系为：Tris-HCL(PH 8.3)9.6MM、KCL 48MM、dNTPs 0.192MM/each、MgCL₂1.44MM，储存于-20℃，

D液：阴性对照(阳性内对照)健康人外周血单个核细胞cDNA溶液，

E液：阳性对照-BCR/ABL b3a2阳性K562细胞系cDNA溶液，

F液：阳性对照-BCR/ABL e1a2阳性患者cDNA溶液，

G液：阳性对照-BCR/ABL b2a2阳性患者cDNA溶液；

(2)采用广泛表达的转录因子增强子结合因子基因(E2A)的mRNA作为阳性内对照；

(3)巢式第一轮PCR(25μl体系)：各取患者cDNA、阴性对照D液和阳性对照E液2μl，各取B液22ul，Taq DNA聚合酶0.5μl(1.25U)，PCR条件为：95℃5min后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环，结束反应；

(4)巢式第二轮PCR(25ul体系)：各取C液22μl，相应的第1轮PCR产物2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl(1.25U)。PCR反应条件同第一轮。

本发明提供的一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，采用特异性的反转录引物，提高转录效率，采用多重巢式PCR方式增加PCR效果，较短时间内快速检测出BCR/ABL融合基因及其不同突变体，为疾病的早期诊断及靶向治疗提供依据。

附图说明

图1为BCR/ABL融合基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳EB染色后紫外灯下成像结果。

具体实施方式

下面结合本发明实施例提供的快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的方法进行详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的一种快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)A液：特异性逆转录引物

引物ABL(RT)及E2A(RT)等比例用DEPC水稀释混匀，浓度为2.5pmol/μl，

B液：巢式第一轮PCR反应液500μl(20测试)：

包含引物为：BCR-1，BCR-3，ABL-1，E2A-1，E2A-3，

第一轮多重PCR引物100pmol/条，缓冲体系为：Tris-HCL(ph 8.3)8.8MM、KCL 44MM、dNTPs 0.16MM/each、MgCL₂1.32MM。储存于-20℃，备用，

C液：巢式第二轮PCR反应液500μl(20测试)：