[发明专利]表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法

摘要

一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，包括如下步骤：鼠尾胶原的制备、人成纤维细胞的培养、表皮干细胞的培养、复方壳多糖组织工程皮肤的制备与观察、复方壳多糖组织工程凝胶的制备与观察。本发明证实了在体外利用复方壳多糖组织工程皮肤和凝胶三维培养，一定浓度的表皮生长因子(EGF)诱导、垂直振荡培养，能形成管腔样结构，且所形成的管腔样结构，在形态学、组织学及功能上与在体汗腺分泌部细胞相似，具有与正常汗腺分泌部细胞相似的生理结构及生理作用基础。

主权项

一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)鼠尾胶原的制备将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D‑Hanks液冲洗，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用；2)人成纤维细胞的培养将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，再用PBS液反复冲洗；去除皮下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上揭下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着取出液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待原代培养的FB接近或达到融合后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收缩裂隙时，用含10％FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。3)表皮干细胞的培养先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤：a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本发白发涨；b)将上述步骤a)中的人包皮标本剪去皮下组织后剪成长方形的条状，然后进行分离消化；c)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，对人包皮标本的表皮和真皮进行分离，将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再放入K‑SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K‑SFM培养液；再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤：d)待原代表皮干细胞融合约70％后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤；e)每孔加入0.25％胰蛋白酶后放入冰箱，保持在4℃；f)待4h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；g)将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心；h)弃去上清液，加入K‑SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用；4)复方壳多糖组织工程皮肤的制备按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2‑7.4；在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8×10⁵/ml的1代表皮干细胞，最后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养，将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加EGF；两组均每日垂直振荡；待培养16天后，用4％多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况；5)复方壳多糖组织工程凝胶的制备按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2‑7.4；在凝胶中加入1代表皮干细胞，细胞量为8×10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，再加入KGM，置孵箱中培养，每天进行换液；每日垂直振荡；待培养3天后，在KGM中添加浓度为20ng/ml的EGF；待培养16天后行组织学及形态学检查；6)组织工程凝胶的观察步骤包括组织学观察、免疫荧光观察、透射电镜下观察以及激光共聚焦显微镜观察钙通道。