[发明专利]表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离和培养方法，特别涉及一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法。

背景技术

严重的皮肤缺损，如大面积的深度烧伤等，伤及皮肤全层及其附属器，仅靠创面自身难以实现皮肤再生，需要足够的皮肤替代物进行修复。目前构建的表真皮双层组织工程皮肤虽已应用于临床，基本解决了创面覆盖的问题，但未达到真正的皮肤组织结构和功能的完全重建，其最大的问题是缺乏皮肤附件，如皮脂腺、汗腺等附属器。表皮干细胞(Epidermal stem cell,ESC)是皮肤组织特异性干细胞，位于表皮基底层，在维持表皮更新，保持细胞恒定等方面起着重要作用。表皮干细胞具有多向分化潜能，体内证实能够向皮肤附属器及表皮分化。若能在体外诱导表皮干细胞向汗腺分化，将为研究带汗腺的组织工程皮肤提供重要实验依据。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法。

为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种表皮干细胞向汗腺样上皮细胞分化的方法，包括如下步骤：

1)鼠尾胶原的制备

将冻存的大白鼠鼠尾在酒精溶液中解冻后，去皮，采用D-Hanks液冲洗，抽出尾腱，剪碎成泥，溶于无菌的冰醋酸中保存一段时间，其间反复振荡，然后进行离心处理，提取上清溶液，得到乳白色半透明粘稠液体，即为所得物鼠尾胶原，将其贮存备用；

2)人成纤维细胞(FB)的培养

将健康成人包皮环切术的包皮标本用酒精浸浴并擦拭，用PBS液反复冲洗；去除皮下组织和真皮网状层，将表真皮部分剪成长方形条状后进行消化；然后将表皮从真皮上揭下，刮真皮表面，将所得真皮剪成糊状，加胶原酶，再加盖，移至孵箱中并不时摇动；接着取出液体，筛网过滤，加PBS液，离心弃上清，加DMEM混匀成细胞悬液，移入孵箱中培养，待原代培养的FB接近或达到融合后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，当细胞体积增大，出现收缩裂隙时，用含10％FBS的DMEM培养接终止消化，最后分析细胞体积及增殖情况，并按照1:3传代，建立FB细胞库，提供来源统一的FB。

3)表皮干细胞的培养

先将人表皮干细胞的原代分离培养，包括下列步骤：

a)将取下的人包皮标本用酒精浸泡并擦拭后，再用PBS平衡盐液冲洗，直至标本发白发涨；

b)将上述步骤a)中的人包皮标本在培养皿中剪去皮下组织后剪成长方形的条状，然后进行分离消化；

c)将步骤b)中的人包皮标本用PBS平衡盐液漂洗，然后对人包皮标本的表皮和真皮进行分离，再将分离后所得的表皮进行消化，消化后进行离心、筛网过滤，弃去上清液，再放入K-SFM培养液中，制成细胞混悬液，计算细胞活力及细胞数，细胞按5×10⁴/孔接种在预先铺满IV型胶原的培养板中，30min后吸尽未贴壁的细胞，计算吸出液中的细胞数和贴壁率，并每天更换K-SFM培养液；

再进行人表皮干细胞的传代培养，包括下列步骤：

d)待原代表皮干细胞融合约70％后，弃去细胞培养液，用PBS进行洗涤；

e)每孔加入0.25％胰蛋白酶后放入冰箱，保持在4℃；

f)待4-6h后将培养板取出，轻轻拍打细胞脱落，加入含10％FBS的DMEM中和；

g)将液体吸入离心管中，用PBS轻轻冲洗培养板后移入离心管中进行离心；

h)弃去上清液，加入K-SFM培养基重悬细胞后，计算细胞数后备用；

4)复方壳多糖组织工程皮肤的制备

按比例混匀醋酸鼠尾胶原、壳多糖、硫酸软骨素、透明质酸、弹性蛋白及浓缩DMEM；再用氢氧化钠调节pH值至7.2-7.4；在凝胶中加入FB细胞，细胞量达到10⁵/ml；吸入多孔培养板中，放入孵箱内待形成凝胶后，每孔轻轻加入浓度为8×10⁵/ml的1代表皮干细胞，最后再加入KGM培养基，置孵箱培养，每天进行换液；待培养3天后，进行行气液界面培养，将组织工程皮肤分为两组：一组仅用KGM培养，一组在KGM中添加20ng/ml EGF；两组均每日垂直振荡；待培养16天后，用4％多聚甲醛固定后行HE染色，观察皮肤生长情况；

5)复方壳多糖组织工程凝胶的制备