[发明专利]一种植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法及应用

摘要

本发明公开了一种植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法及应用，其中，植物乳杆菌FB-T9的有效提取物中含有小分子细菌素类物质和过氧化氢成分，不仅对浮游状态的变异链球菌具有抑菌活性，而且在生物膜状态下，也能发挥较好的抑菌活性，破坏生物膜结构的完整性。所述的植物乳杆菌FB-T9用于含有其代谢产物的发酵食品或药物组合物，用于预防、减少或治疗龋齿，具有非常广泛的应用前景。

主权项

一种植物乳杆菌代谢产物抑制性的分析方法，其特征在于：包括，植物乳杆菌FB‑T9代谢产物对变异链球菌生物膜形成的影响分析，其包括：(a)对变异链球菌生物膜形成量的影响：制备变异链球菌菌悬液；在0h时，在培养介质中加入变异链球菌菌悬液，在培养中的第0h，第6h，第12h这三个时间点，分别加入植物乳杆菌FB‑T9发酵上清液，一起培养到24h；或者把变异链球菌单独培养24h或48h，去除培养基及浮游的细菌，再加入植物乳杆菌FB‑T9发酵上清液；阴性对照组和阳性对照组分别加入等量的生理盐水和醋酸氯己定溶液；培养结束后，弃游离细菌，去离子水洗涤，自然干燥；加入结晶紫溶液，室温下染色，使结合的细菌着色；倾去染色液后，去离子水洗涤，干燥后加入混合的乙醇/丙酮混合液显色，酶标仪600nm测定吸光度；(b)对变异链球菌生物膜结构和活性的影响：生物膜标本制备：在培养皿中加入变异链球菌菌悬液和含有0.25％蔗糖的TSB培养基，在培养时间为第0h、6h、12h时分别加入植物乳杆菌FB‑T9发酵上清液，每个时间点培养3个样品，厌氧培养24h，PBS冲洗，去除表面浮游细菌，立即于室温下暗箱中染色；或者先培养变异链球菌，形成24h或48h生物膜后，去除培养基，PBS洗涤，去除表面浮游细菌，加入植物乳杆菌FB‑T9发酵上清液，厌氧培养24h，去除浮游菌，荧光染色；荧光染料的配制及染色：用荧光染料CFSE、PI分别对活菌、死菌进行染色，使得活细菌、死细菌分别发出绿色荧光，红色荧光，从而可以观察到生物膜结构，染色结束后用PBS洗涤，除去残留染料；激光共聚焦显微镜观察：将上述已完成荧光染色的生物膜标本放置在CLSM下观察，物镜×20，目镜×10，观察生物膜结构的激发光为510/480。以样本最强信号点为焦平面，以该平面为参照点，沿Z轴进行2um为步距进行断层扫描，最后进行三维重建，得到生物膜立体结构，处理记录生物膜厚度、细菌总面积、活菌面积、死菌面积及计算活菌百分比；植物乳杆菌FB‑T9代谢产物对变异链球菌生物膜中胞外多糖的影响分析：采用如步骤(b)中的方法制备生物膜标本，用荧光染料使胞外多糖发出蓝色荧光，用CLSM观测时使用的激发光为400～490nm；对生物膜状态下变异链球菌合成不溶性胞外多糖的影响分析，其包括：在聚苯乙烯细胞培养皿中，加入变异链球菌菌悬液和含有0.25％蔗糖的TSB培养基，厌氧培养；在变异链球菌24h生物膜形成中的第0h、6h、12h时加入植物乳杆菌FB‑T9发酵上清液，24h后去除培养基，PBS洗涤，去除表面浮游的细菌；或者加入变异链球菌菌悬液和含有0.25％蔗糖的TSB培养基，厌氧培养，形成24h或者48h生物膜，去除培养基，PBS洗涤，去除表面浮游的细菌，加入植物乳杆菌FB‑T9发酵上清液，厌氧培养24h，去除孔内的液体，PBS洗涤，去除表面浮游的细菌；加入NaOH，收集菌体，收集上清液，沉淀再用NaOH洗涤，合并上清液，作为水不溶性胞外多糖的样品；用蒽酮‑硫酸法测胞外多糖的含量。