[发明专利]一种筛选山羊免疫相关基因DQA1Exon2‑(A‑C)等位基因型的方法

摘要

本发明公开了一种筛选山羊免疫相关基因DQA1 Exon 2‑(A‑C)等位基因型的方法，根据DQA1基因外显子2的序列设计引物，以白山羊的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化测序，初步筛选DQA1基因的外显子2的多态性位点，以白山羊基因组DNA为模板，PCR扩增目的片段，用变性剂处理PCR产物，对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，应用银染法染胶，并根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定贵州白山羊DQA1基因外显子2的部分等位基因型。本发明为不同品种山羊DQA1基因外显子2多态性的PCR‑SSCP筛选及判型提供一种方便、快捷、准确的方法，能够检测山羊免疫性状相关的DQA1基因第二外显子的部分等位基因，解决了目前PCR‑SSCP技术对于呈高度多态性基因判型困难的问题。

主权项

一种筛选山羊免疫相关基因DQA1基因外显子2上的三种基因型的方法，其特征在于：A、同时将待检测基因组DNA，DQA1 Exon 2‑A、DQA1 Exon 2‑B和DQA1 Exon 2‑C的DNA标准样1.5μL分别与试剂Ⅰ混合，按PCR反应条件进行目的片段的扩增；B、取3μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测，产物片段大小为406bp；C、向步骤B中剩余的PCR产物中各加入10μL上样变性缓冲液，98℃水浴15min,冰浴15min；D、将试剂Ⅱ与540μL 10%过硫酸铵，30μL TEMED混匀，制电泳胶，其中，所述电泳胶为12%非变性聚丙烯酰胺凝胶；E、将步骤C中的样品，采用步骤D中制取的电泳胶按PCR‑SSCP检测方法进行检测；F、步骤E中检测到的带型与DQA1 Exon 2‑A、DQA1 Exon 2‑B和DQA1 Exon 2‑C的DNA标准样一致的即为已知等位基因型个体；所述试剂Ⅰ总体积13.5μL，其中2×Es Taq MasterMix为7.5μL，上下游引物各0.75μL，余量为ddH2O；其中上游引物为5’‑GAAGCCCACAATGTTTGATAG‑3’，下游引物：5’‑TCATACCAGCTTCACTCCCT‑3’；所述试剂Ⅱ中Arc:Bis=29:1，成分包括5×TBE 15mL，30%丙烯酰胺 30mL，ddH2O 30 mL；所述DQA1 Exon 2‑A的DNA标准样的核苷酸序列为：gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgagg atcttttctc   60tgtttttccc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat   120aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga   180agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa   240atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcttcaggga aacggacttt   300ggagatcatg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcgccatt   360ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct                  406所述DQA1 Exon 2‑B的DNA标准样的核苷酸序列为：gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc   60tatttttccc tttctggctc ctcaccctga ctcagctgac cacattggca cctatggcat   120aagcatctac caaacatatg gtccctctgg ctactatacc catgaatttg atggagatga   180agagttctac gtggacctgg aaaagaggga gactgtctgg cgtctgcctg agtttagtaa   240atttgcaagt tttgaccctc agggtgcact gagaaacata gccacgataa aacataattt   300ggaggtcttg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtatgt gttcaccatt   360ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct                  406所述DQA1 Exon 2‑C的DNA标准样的核苷酸序列为：gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc   60tattttttcc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat   120aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga   180agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa   240atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcgtctggga aacagacttt   300ggagatcatg attcaaagct ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcaccatt   360ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct                  406。