[发明专利]一种筛选山羊免疫相关基因DQA1Exon2‑(A‑C)等位基因型的方法

权利要求书

1.一种筛选山羊免疫相关基因DQA1基因外显子2上的三种基因型的方法，其特征在于：

A、同时将待检测基因组DNA，DQA1 Exon 2-A、DQA1 Exon 2-B和DQA1 Exon 2-C的DNA标准样1.5μL分别与试剂Ⅰ混合，按PCR反应条件进行目的片段的扩增；

B、取3μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测，产物片段大小为406bp；

C、向步骤B中剩余的PCR产物中各加入10μL上样变性缓冲液，98℃水浴15min,冰浴15min；

D、将试剂Ⅱ与540μL 10%过硫酸铵，30μL TEMED混匀，制电泳胶，其中，所述电泳胶为12%非变性聚丙烯酰胺凝胶；

E、将步骤C中的样品，采用步骤D中制取的电泳胶按PCR-SSCP检测方法进行检测；

F、步骤E中检测到的带型与DQA1 Exon 2-A、DQA1 Exon 2-B和DQA1 Exon 2-C的DNA标准样一致的即为已知等位基因型个体；

所述试剂Ⅰ总体积13.5μL，其中2×Es Taq MasterMix为7.5μL，上下游引物各0.75μL，余量为ddH₂O；其中上游引物为5’-GAAGCCCACAATGTTTGATAG-3’，下游引物：5’-TCATACCAGCTTCACTCCCT-3’；

所述试剂Ⅱ中Arc:Bis=29:1，成分包括5×TBE 15mL，30%丙烯酰胺 30mL，ddH₂O 30 mL；

所述DQA1 Exon 2-A的DNA标准样的核苷酸序列为：

gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgagg atcttttctc 60

tgtttttccc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat 120

aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga 180

agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa 240

atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcttcaggga aacggacttt 300

ggagatcatg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcgccatt 360

ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406

所述DQA1 Exon 2-B的DNA标准样的核苷酸序列为：

gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc 60

tatttttccc tttctggctc ctcaccctga ctcagctgac cacattggca cctatggcat 120

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ggaggtcttg attcaaaggt ccaactctac tgctgctacc aacagtatgt gttcaccatt 360

ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406

所述DQA1 Exon 2-C的DNA标准样的核苷酸序列为：

gaagcccaca atgtttgata gtcaatttct tctttcactg cttaatgaag atcttttctc 60

tattttttcc tttcttgctc ctcactccga ctcagctgac cacattgccg cctatggcat 120

aaacgtctac cactcatatg gtccctctgg ccactatacc catgaatttg atggagatga 180

agagttctac gtcgacctgg aaaagaagga gactgtctgg cgcctgcctg agtttagtaa 240

atttgtaggt tttgaccctc agggtgcact gagaaacatg gcgtctggga aacagacttt 300

ggagatcatg attcaaagct ccaactctac tgctgctacc aacagtaagt gttcaccatt 360

ctgcctctct ttattaatct tccccttcat accagcttca ctccct406。