[发明专利]用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法

摘要

本发明公开了一种用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，包括精子的制备、精子裂解后沉淀其中的DNA、制备精子蛋白、制备蛋白提取样品、第一向等电聚焦电泳、第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、用考马斯亮蓝染色、制备的凝胶、图像扫描仪扫描。本发明方法使用Trizol彻底裂解精子，氯仿抽提蛋白，异丙醇、盐酸胍、乙醇去除杂质，丙酮纯化蛋白，很好的解决了小鼠精子含量少，采集困难，细胞体积小，细胞质少，富含顶体蛋白酶的问题。采用本发明方法得到的样品制备全、分离蛋白点多、重复性好、图谱清晰，经PDQuestsoftware软件检测，蛋白点多于1000个，为进一步质谱分析打好基础。

主权项

用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，包括如下步骤：（1）将成熟雄性小鼠断颈处死，把两侧附睾尾及输精管的精子冲出，‑80℃保存备用；（2）将（1）取得的精子在室温解冻后，在4℃、12,000g条件下离心10 min沉淀精子；（3）将（2）获得的精子按照1. 5 ×107个精子/mL Trizol液裂解，置于1.5ml Ep管中，用200μl枪头反复吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20 μL β‑巯基乙醇(β‑ME) ， 65 ℃ 水浴60 min，然后加入0. 2 mL氯仿， 振荡20s， 28℃水浴锅中孵育5 min，12 000g、4℃ 离心15 min，得到分层的混合物，吸取分层混合物的下层500μl‑700μl有机相转移至新管中，加入无水乙醇0. 3 mL， 4℃、12,000g 离心5 min， 使其中的DNA 沉淀；（4）取（3）离心后的上清部分500μl‑700μl转移至2mL新管中， 加入1.5mL异丙醇， 振荡30 s，在28℃ 水浴锅中孵育10 min， 12 000g、4 ℃ 离心10 min 沉淀蛋白，弃上清；加入2 mL 洗液，用200μl枪头反复吹打10次，洗涤蛋白沉淀，28℃水浴锅中孵育20 min，12 000 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清，重复3 次；然后再用无水乙醇重复洗涤蛋白3 次，最后在室温下干燥10‑20 min，待无水乙醇挥发殆尽为止；（5）将（4）制备的精子蛋白沉淀溶于50μl‑100 μl样品水化液中，加入400 μl丙酮，‑20℃纯化15min，4℃、12,000g离心5 min，弃上清，再加入样品水化液50μl‑100μl，在4 ℃ 下静止12 h，然后在4 ℃、12 000g离心10 min，弃不溶物，取上清，然后采用Bradford法对上清进行蛋白定量，重复3次，求平均值；（6）根据（5）定量的蛋白浓度，计算出上样200μg‑500μg所需的（5）中蛋白提取样品的体积，制备的蛋白提取样品和样品水化液加入聚焦盘中，使终体积在125μl‑250μl之内，将胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油3‑5ml，充满整个胶条槽，室温下被动水化15小时后的胶条进行第一向等电聚焦电泳；（7）经（6）处理后的胶条，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅰ，水平摇动15min，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅱ，水平摇动15min，然后将胶条转移至12%的SDS‑聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶，加入封胶液去除气泡后，进行第二向SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是：15mA 30min，20 mA 100min；（8）经（7）处理后的胶条用纯水洗3次，每次15min，然后用考马斯亮蓝染色液染色5h，再用超纯水脱色3次；（9）将（8）制备的凝胶用图像扫描仪扫描，即得电泳图谱。